錢宏梁，潘志強(qiáng)，彭佩克，盧濤，錢楊楊，宋秋佳，費敏紅，方肇勤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

證候動物模型是中醫(yī)證候基礎(chǔ)學(xué)研究的重要內(nèi)容。在開展證候動物模型時究竟選擇哪種品種與品系，是研究者首要取舍的問題，基于此，本文在課題組既往大量的小鼠證候研究基礎(chǔ)上[1-2]，比較常用5種品系小鼠對糖皮質(zhì)激素藥物潑尼松龍的反應(yīng)，以明確最適合作為糖皮質(zhì)激素藥源性證候的實驗小鼠，為后續(xù)建立“糖皮質(zhì)激素藥源性證候模型標(biāo)準(zhǔn)化方法與評價體系”奠定基礎(chǔ)。

糖皮質(zhì)激素是一種類固醇激素，生理上發(fā)揮不可或缺作用，而機(jī)體在多種病理狀態(tài)下需要補(bǔ)充外源性糖皮質(zhì)激素藥物以發(fā)揮抗病作用。值得注意的是，大劑量或長期使用糖皮質(zhì)激素藥物不可避免產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，從中醫(yī)學(xué)理論上分析可以辨證相關(guān)的證候，稱之為糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的“藥源性證候”[3]。本研究以0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍連續(xù)灌胃5種小鼠14 d后，觀察其對不同品系小鼠的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性ICR、BALB/c、C57BL/6J和BALB/c裸小鼠共64只，SPF級，5周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】；雄性KM小鼠16只，SPF級，20～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】。小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房【SYXK (滬) 2014-0008】。實驗倫理聲明：本設(shè)施的環(huán)境條件符合中國國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》(GB14925-2001)對普通動物實驗設(shè)施的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，動物飼養(yǎng)管理和動物實驗操作符合《實驗動物管理條例》。實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)號SZY201803011。

1.1.2 藥物與試劑

醋酸潑尼松龍片(國藥準(zhǔn)字H31020771)，購自上海上藥信誼藥廠有限公司。TRIzol購自Invitrogen公司。PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)II購自TaKaRa公司。采用Primer3(v.0.4.0)在線軟件設(shè)計引物，見表1，并委托Life Technologies公司合成。皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(貨號501320)購自美國Cayman公司，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒 (貨號M046006)購自美國Mdb公司。LDL Receptor抗體 (ab52818)、SR-BI抗體 (ab52629)、StAR抗體(ab96637)均購自美國Abcam公司。β-actin抗體(貨號A5441)購自Sigma-Aldrich公司。

表1 小鼠腎上腺皮質(zhì)功能基因Table 1 Genes of adrenal cortical function in the mice

1.1.3 實驗設(shè)備

四診設(shè)備：YLS-13 A型小鼠抓力測定儀(購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)，底部劃有5 cm×5 cm方格(3行×5列=15格)的實驗籠，ThermaCAM P30型紅外熱像儀器(購自美國FLIR公司)。QuantStudioTM3實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)，Elx800型酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)，Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Protein-Simple公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，ICR、BALB/c、C57BL/6J、KM和裸鼠均隨機(jī)分為2組：正常對照組(n=8)，潑尼松龍組(n=8)。潑尼松龍組灌胃0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍(此劑量則是根據(jù)臨床常用量每日30 mg/kg 折算到小鼠所得)，每日1次；正常對照組灌胃等體積的滅菌水。

1.2.2 四診指標(biāo)觀測

在實驗第14天，運用小鼠辨證論治實驗方法學(xué)采集小鼠四診信息：一般外觀表現(xiàn)、體重、軀體不同部位紅外溫度、曠場實驗活動度(計算方法：在網(wǎng)格中活動60 s的跨格數(shù)以及前肢離地次數(shù)的總和)、四肢抓力、腋溫等表征信息，然后進(jìn)行計量化辨證。具體參見有關(guān)文獻(xiàn)[1,4-6]。

1.2.3 取材

在實驗第15天處死小鼠，先稱體重，取材如下：

(1)眼球取血，分離血清，檢測皮質(zhì)酮與ACTH含量。

(2)脾、胸腺稱取重量并計算臟器指數(shù)。脾指數(shù)=脾重量(mg)/體重(g)。

(3)取腎上腺組織檢測Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2的mRNA表達(dá)，以及LDLR、SRBI、StAR蛋白表達(dá)。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測基因mRNA表達(dá)

按照TRIzol試劑盒說明書抽提腎上腺總RNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37℃×15 min，85℃×5 s，4℃；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95℃×3 min，95℃×5 s，60℃×30 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量分析方法：采用2-ΔΔCT法分析。

1.2.5 ELISA檢測血清激素

依據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，用血清樣本檢測皮質(zhì)酮和ACTH含量。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

采用RIPA裂解液處理腎上腺組織，提取蛋白質(zhì)樣品并定量，通過變性后，分別執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等常規(guī)實驗流程，其中，一抗?jié)舛葍?nèi)參β-actin以1∶20000稀釋，LDLR抗體以1∶5000稀釋，SRBI、StAR抗體均以1∶2000稀釋。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism7.0專業(yè)軟件進(jìn)行作圖、及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠四診指標(biāo)

2.1.1 體重動態(tài)變化(陰盛衰程度)

與各自正常對照組比較，給藥潑尼松龍后小鼠體重均出現(xiàn)增長減緩。其中，給藥后第7天起，ICR小鼠體重顯著下降(P<0.01)；給藥后第13天起B(yǎng)ALB/c小鼠體重顯著下降(P<0.01)；給藥后第5天起C57BL/6J小鼠體重顯著下降(P<0.01)；給藥后第13天裸鼠體重顯著下降(P<0.05)，見圖1。

注：a為ICR小鼠，b為BALB/c小鼠，c為C57BL/6J小鼠，d為KM小鼠，e為裸鼠。與各自的正常對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。(下圖同)。圖1 體重動態(tài)變化Note. a：ICR mice; b：BALB/c mice; c：C57BL/6J mice; d：KM mice; e：nude mice. Compared with their normal control groups,* P<0.05,**P<0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Dynamic changes of body weight

2.1.2 曠場活動度、抓力差異(氣盛衰程度)

與正常對照組比較，潑尼松龍給藥后5種小鼠抓力均有一定下降，其中潑尼松龍給藥后ICR小鼠抓力顯著下降(P<0.05)，見圖2。

2.1.3 不同部位紅外溫度、腋溫差異(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，潑尼松龍給藥后ICR小鼠腋溫、頭部最高溫度、軀干平均溫度、尾部最低溫度均有一定下降，其中軀干平均溫度顯著下降(P<0.01)。其他小鼠不同部位紅外溫度、腋溫均有一定程度下降但未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2。

注：a為小鼠抓力，b為小鼠曠場活動度，c為小鼠腋溫，d為頭部最高溫度，e為軀干平均溫度，f為尾部最低溫度。圖2 四診指標(biāo)變化Note.a, Holding power. b, Activity degree of open field. c, The axillary temperature. d, The highest temperature of head. e, The average temperature of body trunk. f: The lowest temperature of tail.Figure 2 Changes of four diagnostic indexes

2.2 小鼠臟器變化

2.2.1 脾重量及指數(shù)

與正常對照組比較，潑尼松龍給藥后5種小鼠脾重量指數(shù)均出現(xiàn)下降，其中，ICR和裸鼠的脾重量顯著下降(P<0.01)，裸鼠脾指數(shù)顯著下降(P<0.05)，見圖3。

2.2.2 胸腺重量及指數(shù)

與正常對照組比較，潑尼松龍組小鼠胸腺重量指數(shù)均出現(xiàn)下降。其中，ICR、C57BL/6J和KM胸腺重量指數(shù)顯著下降(P<0.01)，BALB/c潑尼松龍組胸腺重量指數(shù)變化不明顯，見圖3。此外裸鼠免疫缺陷故無胸腺。

圖3 潑尼松龍對小鼠脾、胸腺重量以及指數(shù)影響Figure 3 Effects of prednisolone on the mass and index of mouse spleen and thymus

2.3 血清皮質(zhì)酮與促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量

與正常對照組比較，BALB/c的血清皮質(zhì)酮與ACTH含量下降顯著(P<0.05或P<0.01)；KM血清皮質(zhì)酮含量下降顯著(P<0.01)，見圖4。

圖4 血清皮質(zhì)酮與ACTH水平變化Figure 4 Changes of serum corticosterone and ACTH

2.4 腎上腺類固醇激素合成酶的基因表達(dá)

類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Star)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(Cyp11a1)、21-羥化酶(Cyp21a1)、11β-羥化酶1(Cyp11b1)和11β-羥化酶2(Cyp11b2)是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞腎上腺類固醇激素合成過程中的重要酶。

如圖5所示，與正常對照組比較，ICR小鼠的Cyp21a1基因顯著下調(diào)(P<0.05)；裸鼠的Star基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Cyp21a1基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

與正常對照組比較，C57BL/6J潑尼松龍組小鼠Star基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

與正常對照組比較，KM潑尼松龍組小鼠Cyp11a1、Cyp21a1基因顯著下調(diào)60%～70%(P<0.01)。

總體分析，0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍對BALB/c、C57BL/6J小鼠的腎上腺功能抑制程度較輕，而對KM小鼠的抑制程度較強(qiáng)。潑尼松龍對ICR小鼠腎上腺合成類固醇激素過程的相關(guān)基因均出現(xiàn)抑制且抑制程度在10%～30%之間較為穩(wěn)定。

2.5 腎上腺類固醇激素合成相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖6所示，與正常對照組比較，潑尼松龍顯著抑制ICR小鼠腎上腺LDLR蛋白表達(dá)、StAR蛋白表達(dá)有所下降。潑尼松龍顯著抑制KM小鼠腎上腺StAR蛋白表達(dá)。然而，潑尼松龍給藥后BALB/c、C57BL/6J以及裸鼠的腎上腺LDLR、SRBI、StAR蛋白表達(dá)未呈現(xiàn)顯著變化。

注： a.正常對照組；b.潑尼松龍組。圖6 小鼠腎上腺類固醇激素合成蛋白表達(dá)Note. a, Normal control group. b, Prednisolone group.Figure 6 Expression of adrenal steroid synthetic protein

低密度脂蛋白受體(LDLR)是一種細(xì)胞表面糖蛋白在膽固醇代謝中起關(guān)鍵作用[7]。而B族I型清道夫受體(SR-BI)是高密度脂蛋白的受體[8]。類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)是膽固醇的一種轉(zhuǎn)運蛋白對合成類固醇激素有調(diào)節(jié)作用[9]。

從以上腎上腺蛋白表達(dá)的變化來看，0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍對于ICR和KM小鼠腎上腺攝取膽固醇以及將膽固醇轉(zhuǎn)化為腎上腺皮質(zhì)激素過程有一定抑制作用。

3 討論

3.1 潑尼松龍的毒理呈現(xiàn)的類似中醫(yī)證候

潑尼松龍是臨床常用的糖皮質(zhì)激素藥物，具有抗炎、免疫抑制、抗休克、抗毒等藥效[10]。潑尼松龍常見的不良反應(yīng)包括①大劑量給藥后可能出現(xiàn)全身性的過敏反應(yīng)、各種細(xì)菌真菌和皰疹病毒感染，還有面部、鼻黏膜及眼瞼腫脹，蕁麻疹，氣短，胸悶，喘鳴等癥狀。推測中醫(yī)證候以火毒壅盛、陽浮陰弱、上盛下虛為主。②長程用藥可引起醫(yī)源性柯興綜合征面容和體態(tài)、體重增加、下肢浮腫、骨質(zhì)疏松或骨折、肌無力、消化性潰瘍或腸穿孔，兒童生長受到抑制和腎上腺軸功能減退。推測中醫(yī)證候以脾腎兩臟的陽氣虛衰、水濕壅盛為主。③停藥后出現(xiàn)血壓偏低、頭暈、頭疼、昏厥傾向、腹痛或背痛、低熱、食欲減退、惡心、嘔吐、肌肉或關(guān)節(jié)疼痛、乏力、軟弱。推測中醫(yī)證候以全身性的氣虛和陰陽兩虛為主。

總之，潑尼松龍短時間引起的證候主要以陰虛火旺為主，長時間引起的證候主要陽、氣虛衰及腎虛為主。本實驗通過小鼠辨證論治實驗方法學(xué)評估小鼠的氣、陰、陽三個方面的盛衰。結(jié)果表明，小鼠體重下降陰虛見證顯著于臨床表現(xiàn)類似。小鼠腎上腺功能下降、脾和胸腺萎縮出現(xiàn)腎虛、氣虛見證顯著，臨床相關(guān)表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松或骨折、肌無力、乏力、軟弱等常見癥狀。

3.2 潑尼松龍誘導(dǎo)藥源性證候特征及其腎上腺皮質(zhì)抑制差異

基于實驗小鼠品系的多樣性，為探索不同品系小鼠對同一藥物作用及其耐受性的差異性，本研究選用目前常用的ICR、BALB/c、C57BL/6J、KM和裸小鼠共5種品系小鼠為受試對象，采用臨床常用的糖皮質(zhì)激素藥物潑尼松龍灌胃小鼠，然后運用本課題組研究與創(chuàng)建的“實驗大鼠/小鼠四診與辨證方法學(xué)”對小鼠證候進(jìn)行評估[1,6]。

體重下降提示機(jī)體物質(zhì)基礎(chǔ)的減少，體重是中醫(yī)“陰”盛衰程度的重要評價指標(biāo)。小鼠曠場活動度和抓力體現(xiàn)機(jī)體的“氣”的盛衰程度。體溫可以最直觀地體現(xiàn)機(jī)體的陽熱程度。脾和胸腺的免疫功能強(qiáng)弱與中醫(yī)“氣”盛衰程度有密切關(guān)系。血清皮質(zhì)酮、ACTH含量、腎上腺類固醇激素合成酶基因變化以及此過程相關(guān)的蛋白是評價中醫(yī)“腎”功能的分子指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從小鼠四診相關(guān)指標(biāo)來看，0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍造成5種小鼠體重增長減緩或下降，其中，KM、BALB/c和裸鼠體重變化相對較小，而對ICR和C57BL/6J的體重影響較大。潑尼松龍給藥后ICR小鼠出現(xiàn)一定程度的氣虛和陽虛見證，KM小鼠出現(xiàn)體溫下降趨勢類似陽虛見證，而其他品系小鼠“氣”和“陽”的盛衰程度變化不顯著。

深入探索潑尼松龍誘發(fā)藥源性證候的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)及其功能變化，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/(kg·d)潑尼松龍造成ICR和裸鼠的脾顯著萎縮以及ICR、C57BL/6J、KM和裸鼠的胸腺顯著萎縮，而BALB/c小鼠脾和胸腺變化均不明顯。從生化指標(biāo)上看，潑尼松龍造成BALB/c小鼠血清皮質(zhì)酮與ACTH含量下降，相對其他品系小鼠最顯著。此外，潑尼松龍對BALB/c、C57BL/6J小鼠的腎上腺合成類固醇激素過程的相關(guān)基因和蛋白抑制程度較小，而對KM小鼠抑制程度相對較強(qiáng)，對ICR小鼠相對較穩(wěn)定。

由于潑尼松龍藥理毒理作用廣泛，王火等[10]發(fā)現(xiàn)甲基潑尼松龍可導(dǎo)致長期腎上腺皮質(zhì)功能抑制，與使用劑量有關(guān)。此外，有臨床觀察發(fā)現(xiàn)6.8 g/d潑尼松臨床用量有增加骨質(zhì)疏松的風(fēng)險[11]?；诖?，國內(nèi)外學(xué)術(shù)界有大量關(guān)于運用潑尼松龍制作骨質(zhì)疏松疾病模型的研究[12]，發(fā)現(xiàn)潑尼松龍具有導(dǎo)致機(jī)體腎藏象虧虛的現(xiàn)象，與本研究結(jié)論相似，然而既往文獻(xiàn)缺乏對其分子機(jī)制的深入認(rèn)識，本研究發(fā)現(xiàn)，提示0.5 mg/(kg·d)劑量的潑尼松龍抑制小鼠體重增長，造成脾和胸腺的萎縮抑制免疫系統(tǒng)功能，抑制垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能，從而呈現(xiàn)類似臨床的“腎虛”或“脾虛”為主的全身性虛弱證候。這有助于從腎上腺皮質(zhì)軸分子功能層面深入揭示潑尼松龍所致的小鼠藥源性證候內(nèi)涵。

4 結(jié)論

糖皮質(zhì)激素藥物潑尼松龍給藥14 d后具有明確的誘導(dǎo)小鼠發(fā)生藥源性虛證的效應(yīng)，以“氣虛”為主，中醫(yī)臟腑定位于“腎藏象”與“脾藏象”；其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)以脾、胸腺免疫功能及其垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能受抑制為主。

從不同品系小鼠綜合比較分析，發(fā)現(xiàn)ICR小鼠對潑尼松龍所致藥源性虛證更為穩(wěn)定，建議后續(xù)開展糖皮質(zhì)激素藥源性虛證研究首選ICR小鼠。