范濤，梁琳，李嘉陽，李剛*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

減蛋綜合征病毒(egg drop syndrome virus, EDSV)屬禽類腺病毒，2005年國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)新的腺病毒分類標(biāo)準(zhǔn)中將EDSV歸為富AT腺病毒屬[1]。該病毒主要引起禽類(雞、鴨、鵝等)產(chǎn)蛋量急劇下降，可在鴨胚細(xì)胞、鴨胚成纖維細(xì)胞中良好增殖，而在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖不良，以鴨為自然宿主[2]，也稱為鴨腺病毒A型。

腺病毒具有宿主范圍廣，致病性低，外源基因承載量大等特點(diǎn)，可作為抗原基因載體制成疫苗，誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)或在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)承載基因產(chǎn)物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)免疫預(yù)防或治療目的。禽腺病毒憑借種屬的差異，對(duì)哺乳動(dòng)物來說有很好的安全性，已成為重要的疫苗載體并得到廣泛的應(yīng)用[3-5]，研究較早且具有代表性的毒種是雞胚致死孤兒病毒(CELOV)，而EDSV是否具備同樣的效果仍需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究選用了3個(gè)品系小鼠模型作為對(duì)象，通過人工感染，觀察EDSV在小鼠體內(nèi)增殖情況以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為該病毒構(gòu)建載體提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

免疫系統(tǒng)正常小鼠BALB/c、T細(xì)胞免疫缺陷小鼠Nu、高度免疫缺陷小鼠NSG，每個(gè)品系32只，SPF級(jí)，雌性，5 ～ 6周齡，體重為14 ～ 16 g，由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所保存并提供【SCXK(京)2014-0013】。動(dòng)物飼養(yǎng)在中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境隔離器中【SYXK(京)2016-0004】。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22 ～ 26℃，相對(duì)濕度40%～70%，壓差≥50 Pa，換氣次數(shù)≥ 20 次/h，空氣潔凈度5級(jí)，明暗交替12/12 h，噪聲≤60 dB。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)在中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督與指導(dǎo)下進(jìn)行【中檢動(dòng)(福)第2016(B)007號(hào)】。

1.1.2 主要儀器

隔離器(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司軟包隔離器，中國)，離心機(jī)(Beckman X-22R，德國)，超速離心機(jī)(Hitachi CP100NX，日本)；紫外分光光度儀(Thermo Nano Drop 2000，美國)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Multiskan Go，美國)；恒溫培養(yǎng)箱(上海智城ZXMP-A1230，中國)；熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI 7500 Fast，美國)；單通道(2 ～ 20 μL、20 ～ 200 μL)、八通道(50 ～ 300 μL)微量移液器(Eppendorf，德國)。

1.1.3 主要試劑耗材

ELISA 96孔可拆式(8×12)聚苯乙烯酶標(biāo)板(NUNC公司，丹麥)，0.1 mL八聯(lián)排管及八聯(lián)排管超凈光蓋(BIO plastics BV，荷蘭)；TaKaRa Premix Ex Taq 試劑、蛋白酶K、RNase A(寶生物工程(大連)有限公司，中國)，乙醇、飽和酚、氯仿、異丙醇等(北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司，中國)；蔗糖密度梯度溶液、1×PBS、抗原包被液、封閉液、PBST洗液、抗體稀釋液、酶結(jié)合物稀釋液、TMB顯色劑、終止液等由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠攻毒與樣本采集

將EDSV病毒液室溫解凍，搖勻。3個(gè)品系小鼠，品系內(nèi)分為實(shí)驗(yàn)組24只，每只小鼠腹腔注射0.1 mL血凝效價(jià)為212的病毒液；對(duì)照組8只，每只腹腔注射同等劑量的PBS。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分開放置于不同隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。分別于攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d，每日選取各品系3只實(shí)驗(yàn)組和1只對(duì)照組小鼠，CO2麻醉，摘除眼球取全血約1 mL，置于1.5 mL離心管中，4℃靜置析出血清，用微量移液器吸取上層血清至新離心管中，編號(hào)，-20℃凍存?zhèn)溆?。選擇攻毒后1、7、14、21、28 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠，剖取心臟、肺、肝、脾、腎、小腸、子宮、氣管、食管、腦10種組織，每種組織取一小塊置于1.5 mL離心管中，用于DNA提取，-80℃凍存。

1.2.2 間接ELISA抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

30% ～ 50%(m/v)5個(gè)間隔相等濃度梯度的蔗糖溶液進(jìn)行超速離心純化抗原；用純化的EDSV抗原包板，抗原稀釋為2、5、7、10 μg/mL 4個(gè)濃度，取已知陽性血清、陰性血清各1份，分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600倍的稀釋，“方陣滴定法”確定抗原最佳包被濃度與血清工作稀釋度，P/N值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的抗原濃度與抗體稀釋度為工作濃度。

1.2.3 間接ELISA方法小鼠血清抗體監(jiān)測

用優(yōu)化后濃度的抗原液包板，100 μL/孔，37℃ 1 h后4℃過夜；設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照各2個(gè)孔，分別加入工作濃度稀釋后的SPF級(jí)小鼠血清、已知EDSV抗體陽性小鼠血清和PBS，待檢血清樣本稀釋后每份平行做2孔，每孔100 μL，用封板膜封板，37℃反應(yīng)1 h；取出后洗板5次，叩干；山羊抗鼠辣根過氧化物酶(goat anti-mouse IgG-HRP)按1∶5000稀釋為工作濃度，每孔加入100 μL，封板，37℃孵箱反應(yīng)1 h，取出后洗板5次并叩干；每孔加入100 μL 底物溶液，放入鋁箔袋，37℃避光顯色10 ～ 15 min；取出酶標(biāo)板，每孔加入50 μL終止液(2 mol/L硫酸)；酶標(biāo)儀設(shè)定波長為450 nm，讀取板上各孔OD值。

1.2.4 TaqMan qPCR檢測EDSV體內(nèi)組織分布

將各組織塊解凍，剪碎，飽和酚/氯仿法提取總DNA，紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度及純度。以EDSV六鄰體蛋白編碼區(qū)基因序列作為目的基因，文獻(xiàn)獲得探針引物[6]；NCBI網(wǎng)站公布的小鼠β-actin蛋白(Actb)基因序列(Gene ID：11461)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)探針引物，由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成。(表1)

根據(jù)TaKaRa Premix Ex Taq 試劑使用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀推薦反應(yīng)體系及條件進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR反應(yīng)體系：PremixExTaq(2×buffer) 10 μL、Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Probe (5 μmol/L) 0.8 μL、ROX Reference Dye2 (50×) 0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.2 μL，qPCR反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)收集熒光信號(hào)。用比較CT法(△△CT)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出相對(duì)定量(RQ)值，再將RQ值取10的對(duì)數(shù)(LgRQ)，轉(zhuǎn)換為數(shù)量級(jí)的形式來判斷變化量[7]。

表1 EDSV、Actb 熒光定量PCR引物及探針Table 1 Primers and probes for EDSV, Actb TaqMan qPCR

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA檢測三種小鼠血清抗體變化規(guī)律

2.1.1 抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

“方陣滴定”結(jié)果顯示，EDSV抗原包被濃度為2 μg/mL，陰性、陽性血清稀釋度為1∶800倍時(shí)，此時(shí)的P/N值最高，為23.10，因此，確定使用該濃度的抗原及血清稀釋度進(jìn)行抗體檢測。(表2)

表2 EDSV抗原包被濃度及血清工作稀釋度結(jié)果Table 2 Results of EDSV coating concentration and serum working dilution

2.1.2 間接ELISA監(jiān)測三種小鼠血清抗體

ELISA檢測結(jié)果顯示(表3)，BALB/c小鼠攻毒3 d即可在血清內(nèi)檢測到抗體的表達(dá)，平均OD值為0.901；至14 d，抗體水平達(dá)到最高，至監(jiān)測期內(nèi)35 d一直維持高水平表達(dá)；Nu小鼠也可于攻毒3 d檢測到抗體，但表達(dá)水平較BALB/c小鼠有所降低，平均OD值為0.587，攻毒14 d后，Nu小鼠血清中抗體水平出現(xiàn)下降，至35 d抗體一直維持在較低的水平；NSG小鼠在整個(gè)監(jiān)測過程中，抗體水平一直處于陰性狀態(tài)。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，繪制三品系小鼠血清抗體變化趨勢圖(圖1)。

表3 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結(jié)果Table 3 ELISA test results of serum antibodies in the three mouse strains

圖1 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結(jié)果比較Figure 1 Comparison of ELISA results of serum antibodies in the three mouse strains

2.2 TaqMan qPCR檢測EDSV組織分布結(jié)果

3個(gè)品系小鼠的10種組織樣本，除NSG小鼠7 d和14 d腦組織中未檢測到病毒含量外，其他樣本目的基因與內(nèi)參基因均可計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量(表4)。同時(shí)，各品系對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，各組織中均未擴(kuò)增出病毒核酸。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BALB/c小鼠感染后1 d，肝組織中的病毒表達(dá)量最高，達(dá)到5.45個(gè)數(shù)量級(jí)，其次由高到低依次是脾、食管、子宮、小腸、肺、氣管、腎、心臟，腦組織中病毒含量最低，隨感染時(shí)間的延長，各組織內(nèi)病毒表達(dá)量較感染1 d均有所下降；至攻毒后28 d，肝、脾病毒表達(dá)量依然維持著較高的水平，腦組織中病毒相對(duì)含量降至最低，其他各臟器組織中仍可檢測到病毒含量(圖2)。

Nu小鼠和NSG小鼠略有差異，其感染1 d表現(xiàn)為脾組織中病毒表達(dá)量最高，分別為3.95和4.05個(gè)數(shù)量級(jí)，其次為肝，Nu小鼠1 d肝病毒含量為3.84個(gè)數(shù)量級(jí)，NSG小鼠為3.82個(gè)數(shù)量級(jí)。隨后兩品系小鼠各器官內(nèi)的病毒表達(dá)量逐步降低，以Nu小鼠最為明顯，于攻毒28 d，兩種小鼠體內(nèi)各器官內(nèi)仍可以檢出陽性信號(hào)，肝、脾病毒表達(dá)量較高。結(jié)果表明，在監(jiān)測期內(nèi)，EDSV可在部分小鼠組織器官內(nèi)始終存在，主要集中在肝、脾等組織中(圖3、圖4)。

表4 三品系小鼠各組織病毒載量相對(duì)定量結(jié)果Table 4 Relative quantitative results of viral load in tissues of the three mouse strains

圖2 EDSV在BALB/c小鼠體內(nèi)組織分布Figure 2 Organ distribution of EDSV in the BALB/c mice

圖3 EDSV在Nu小鼠體內(nèi)組織分布Figure 3 Organ distribution of EDSV in the nude mice

圖4 EDSV在NSG小鼠體內(nèi)組織分布Figure 4 Organ distribution of EDSV in the NSG mice

3 討論

EDSV按原分類屬于禽類腺病毒Ⅲ群，由五鄰體蛋白(penton)、六鄰體蛋白(hexon)與纖維蛋白(fiber)共同構(gòu)成病毒衣殼。試驗(yàn)證明，三種結(jié)構(gòu)性蛋白基因經(jīng)過重組表達(dá)鑒定，均具有免疫原性[8-10]。在EDSV感染禽類的研究中，種鴨可在攻毒3 d檢測到血清抗體，HI效價(jià)可達(dá)8 Log2，并于攻毒后12 d達(dá)到最高[11]；王曉東[12]對(duì)3月齡SPF鴨僅進(jìn)行基礎(chǔ)免疫后，第1周即可檢測出血清抗體，平均HI效價(jià)5.75 Log2，兩周后達(dá)到最高6.75 Log2，抗體水平可維持17周在5 Log2以上。以上結(jié)果都指示出EDSV可快速刺激禽類機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，并產(chǎn)生持久性的抗體保護(hù)。鼠腺病毒(mouse adenovirus, Mad)以小鼠為天然宿主，在實(shí)驗(yàn)鼠群中感染比例約為8.3%[13]。人工感染后15 d ELISA方法可檢測出陽性血清抗體，37 d達(dá)到峰值[14]。本實(shí)驗(yàn)是使用禽腺病毒人工感染小鼠，結(jié)果顯示，該病毒株可使小鼠在短期內(nèi)產(chǎn)生較高水平的抗體，并且可維持35 d抗體持續(xù)檢出，相比鼠腺病毒，EDSV能夠較快地刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，與禽類感染此病毒后的特性相一致。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，動(dòng)物自身免疫機(jī)能對(duì)EDSV抗體的表達(dá)產(chǎn)生著影響。免疫機(jī)能正常的BALB/c小鼠，在抗原刺激后3 d即可檢測出血清抗體，并隨著感染時(shí)程延長，抗體水平逐漸增高，監(jiān)測至35 d，仍然保持著較高的抗體含量。裸小鼠較BALB/c而言，缺少胸腺，體內(nèi)無成熟的T淋巴細(xì)胞，而EDSV像大多數(shù)微生物一樣屬胸腺依賴性抗原(TDAg)，輔助性T細(xì)胞(Th)的缺陷，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)B細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的抗體有所減少，不能持續(xù)產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答。因此，裸鼠的血清抗體產(chǎn)生初期，表達(dá)水平較BALB/c小鼠偏低，監(jiān)測至21 d時(shí)，血清抗體水平下降明顯。NSG小鼠是在NOD小鼠背景基礎(chǔ)上，DNA修復(fù)復(fù)合蛋白Prkdc發(fā)生scid突變，致使小鼠B、T淋巴細(xì)胞缺失，同時(shí)IL2rg缺失突變，阻止了多重受體細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致功能性NK細(xì)胞缺失[15]，動(dòng)物機(jī)體無法產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答與體液免疫應(yīng)答，因此，在整個(gè)抗原刺激過程中，其抗體水平一直維持在陰性，符合該模型特點(diǎn)。

應(yīng)用熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測病毒載量，其優(yōu)勢在于去除了采樣間的誤差，結(jié)果用變化倍數(shù)來表示，用于指示病毒在體內(nèi)含量的變化趨勢。通過比較不同品系小鼠各組織臟器中病毒核酸相對(duì)表達(dá)量可以看出，三品系小鼠均可在腹腔注射病毒液后1 d于體內(nèi)各主要臟器中檢測到病毒，這可能與感染途徑有關(guān)，病毒液隨血液循環(huán)迅速擴(kuò)散至全身各臟器中。BALB/c小鼠感染后1 d，肝為病毒相對(duì)表達(dá)量最高的組織器官，感染至28 d，脾中病毒相對(duì)表達(dá)量最高，肝較脾中病毒水平略低，但依然顯示有較高的表達(dá)量；Nu和NSG兩種免疫缺陷型小鼠表現(xiàn)出攻毒后1 d脾病毒含量最，其次是肝，這可能與其具有的免疫缺陷特性有關(guān)，兩種小鼠的脾均小于免疫正常的小鼠，至28 d時(shí)，其二者肝中病毒相對(duì)表達(dá)量是各組織間最高的，由此說明，EDSV對(duì)小鼠肝與脾有一定的親嗜性。通過三品系小鼠攻毒全程監(jiān)測結(jié)果可以看出，28 d時(shí)體內(nèi)各組織的病毒含量較攻毒1周內(nèi)(1 ～ 7 d)均有所降低，說明動(dòng)物機(jī)體自身對(duì)EDSV有一定的清除作用。病毒在免疫系統(tǒng)正常與免疫缺陷小鼠的體內(nèi)均沒有引起明顯的組織病變，除了動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以外還可能與組織細(xì)胞表面結(jié)合受體有關(guān)。腺病毒有嚴(yán)格的種屬特異性，而EDSV又是介于禽類腺病毒與哺乳動(dòng)物腺病毒的中間體[16]，推測該病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可以增殖表達(dá)，是否引起組織細(xì)胞發(fā)生病變需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

綜上所述，減蛋綜合征病毒可刺激小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)抗體水平表達(dá)量較低，該病毒在小鼠體內(nèi)有肝、脾等組織嗜性特點(diǎn)，為EDSV構(gòu)建新型載體以及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。