楊陽，白海濤*，李玲，陳美雪

(1. 廈門大學附屬第一醫(yī)院 福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院兒內科，福建 廈門 361000； 2. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院兒內科， 武漢 430014； 3. 莆田市兒童醫(yī)院兒內科，福建 莆田 351100)

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性腎病的病理生理基礎。RIF是由于各種原因使間質炎癥細胞浸潤、細胞外基質(extracellular matrixc, ECM)不斷積聚從而導致腎功能減退的動態(tài)過程。而腎小管上皮-間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)作為腎小管間質纖維化的主要細胞學行為，近年來已被廣為接受和研究，但其確切分子機制尚未完全闡明。Wnt/β-catenin信號通路被越來越多證實與纖維化疾病的發(fā)生密切相關，包括特發(fā)性肺纖維化、肝纖維化等。Wnt基因家族目前已有19種基因，16種在成年小鼠腎有不同程度表達。其中Wnt4基因在腎的發(fā)育中發(fā)揮著至關重要的作用，在胚胎腎中，Wnt4主要誘導腎小管間質細胞向上皮細胞轉化，誘導腎小管的形成。Wnt4基因沉默是否通過參與EMT過程，延緩腎間質纖維化，目前相關體內動物實驗尚未見報道。本研究通過構建Wnt4-siRNA載體分別轉染UUO大鼠體內，擬在探討Wnt4基因沉默后對β-catenin表達的影響,以及與腎間質纖維化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠128只，7周齡，體重約180 ～ 220 g，由廈門大學實驗動物中心提供【SCXK(京)2012-0001】，實驗在廈門大學實驗動物中心進行【SYXK(閩)2013-0006】。SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照黑暗交替12/12 h，建模前12 h禁食。所有操作均符合實驗動物倫理學要求。

1.1.2 試劑與儀器

慢病毒載體系統(tǒng)(載體編號：GV115)、293T細胞、大腸埃希菌菌株DH5α、PCR 用試劑primer(R&F)購自上海吉凱基因化學技術有限公司。兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體購自英國Abcam，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自杭州賢至生物科技公司。山羊抗兔二抗購自美國Earthox。兔抗大鼠Wnt4多克隆抗體、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體、兔抗大鼠 vimentin單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司。兔IgG兩步法免疫組化試劑盒即用型購自武漢博士德。Taq polymerase、TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒和RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa。引物由上海英俊生物技術有限公司設計及合成。DMEO購自Gibco公司，胰酶購自上?；瘜W試劑公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。oligo dT購自上海生工，PVDF膜購自美國PALL，BCA蛋白質定量試劑盒購自北京天根生化，DAB顯色盒購自福州邁新生物技術公司，X光膠片購自美國Kodak，ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1Wnt4 siRNA慢病毒載體的構建

選取NRK-52E大鼠腎細胞培養(yǎng)，收集生長狀態(tài)良好的細胞，采用RT-PCR檢測目的基因的表達，篩選出表達豐度較高的細胞類別，用做后期的慢病毒的內篩內驗。根據目的基因序列及siRNA設計原則，分別設計四個Wnt4基因的干擾靶點。構建病毒載體框架。(見表1)。

通過T4DNA連接酶將雙酶切(酶切位點為AgeI，EcoRI)線性化的載體和DNA片段在適當?shù)腷uffer 中進行連接反應，制備雙鏈DNA oligo，連接與轉化慢病毒載體(pGCSIL-GFP載體)與Wnt4 shRNA序列。挑取轉化子重懸于10 μL LB溶液，混勻取1 μL作為模板；使用相應引物：Wnt4上游上游引物CCATGATTCCTTCATATTTGC；下游引物GTAATACGGTTATCCACGCG。進行菌落PCR鑒定實驗。PCR陽性重組子鑒定后，送公司測序。包裝Wnt4 siRNA慢病毒，轉染293T細胞。

表1 Wnt4基因shRNA序列Table 1 Wnt4 shRNA sequences

1.2.2 動物模型制作

180 ～ 220 g的雄性SD大鼠稱重后以1%的戊巴比妥鈉注射麻醉后，固定于動物臺，備皮后醫(yī)用酒精及安爾碘常規(guī)消毒，行左側恥骨上切口(約2 ～ 3 cm),逐層打開腹腔，推開腸管避開肝，沿左腎下極尋找左輸尿管，游離，用5-0號絲線上下結扎兩處，然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染，分層縫合切口并安爾碘消毒；假手術組僅游離左側輸尿管，并不結扎，其余步驟同單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction, UUO) 模型組。

1.2.3 動物分組及體內轉染

實驗設128只SPF級雄性SD大鼠隨機分為4組：根據手術及給藥處理方式的不同，依次為①假手術組(單側輸尿管分離不接扎組，n=32)；②模型組(UUO組，單側輸尿管結扎組，n=32)；③陰性組(單側輸尿管結扎+陰性慢病毒液沉默組，n=32)；④沉默組(單側輸尿管結扎+Wnt4慢病毒液沉默組，n=32)。于術后第3、7、10、14天每組各處死8只動物，留取腎標本。其中陰性組在UUO模型組的基礎上用微量進樣器于腎被膜(單側腎轉染)下注射陰性對照的重組慢病毒液10 μL(含病毒顆粒1×107ifu)，沉默組在UUO組的基礎上采用微量進樣器于腎被膜下注射特異的Wnt4 siRNA慢病毒液10 μL。四組大鼠自由取食并飲水。分別于術后3、7、10、14 d犧牲各組8只大鼠，取腎組織。

1.2.4 冰凍切片制作、標本采集

注射慢病毒液的梗阻側腎組織必須保持新鮮，勿固定，立即制作冰凍切片。Wnt4 siRNA慢病毒濃縮液腎內轉染3 d后犧牲大鼠，立即取梗阻側腎，勿固定，用干凈凍存管裝好。將組織塊置于金屬組織托上面，組織塊在-15℃ ～ -20℃環(huán)境中冰硬，切片厚度為4 ～ 5 μm。切片置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在腎的分布，了解不同劑量組的感染效率。

各組大鼠分別于造模后3、7、10、14 d犧牲大鼠,并取左側腎，冠狀面切開組織，取一部分腎組織(小米粒大小，約1 mm3)置于2.5%戊二醛中固定，待做電鏡。一部分置于4% 中性甲醛中固定，石蠟包埋，待做H&E染色、Masson染色及免疫組化。一部分剝離表面脂肪后分離腎皮質和髓質，包入無菌錫紙中置液氮罐內，再轉移至-80℃冰箱，待做RT-PCR。

1.2.5 H&E染色病理檢測β-catenin、Wnt4、E-cadherin和α-SMA的表達

按常規(guī)方法進行H&E染色，光鏡下觀察四組大鼠腎組織結構病理及腎間質纖維化的改變。按說明書采用兔IgG兩步法免疫組化法染色，結果以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。

1.2.6 RT-PCR檢測β-catenin、Wnt4、E-cadherin和α-SMAmRNA的表達

取各組轉染后3、7、10、14 d 大鼠腎皮質100 mg，采用Trizol試劑提取大鼠腎皮質RNA并逆轉錄成cDNA。經37℃，15 min，85℃ 5 s，逆轉錄合成cDNA，以此為模板用相應引物經PCR 方法進行擴增。設計α-SMA、β-catenin、Wnt4引物，以GAPDH作為內參，以目的基因拷貝數(shù)/GAPDH 拷貝數(shù)作為目的基因的相對表達量。擴增條件為：95℃ 預變性30 s；95℃ 變性15 s，58℃退火20 s、72℃ 20 s，共45 個循環(huán)。融解曲線條件：95℃ 5 s，65℃ 1 min。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠腎間質病理H&E染色結果

H&E染色結果表明：假手術組四個時間點未見腎間質改變；UUO組、陰性沉默組及沉默組造模后3 d出現(xiàn)腎間質水腫、少量腎間質纖維化，10、14 d腎間質彌漫性巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，呈加重趨勢；陰性沉默組基因與UUO組相同；沉默組四個時間點均出現(xiàn)不同程度腎間質纖維化，14 d腎間質纖維化程度低于陰性沉默組及UUO組(P< 0.05)(圖1)。

2.2 Wnt4基因沉默后Wnt4 mRNA相對表達量

假手術組Wnt4 mRNA表達量在四個時間點無明顯變化；UUO組及陰性組Wnt4 mRNA表達量隨著阻斷時間延長增加，與同一時間點的假手術組相比明顯增多(P< 0.05)，第10、14天明顯低于同一時間點的UUO組及陰性沉默組(P< 0.05)(圖2)。

圖1 Wnt4基因沉默后不同時間各組大鼠腎間質H&E染色結果(×200)Figure 1 Pathological changes of renal interstitium of the rats in different groups at different time points after Wnt4 silencing(HE staining,×200)

注：b1表示UUO組、陰性沉默組與假手術組比較，P< 0.05；b2、b3表示沉默組與UUO組、陰性沉默組比較，P< 0.05。(下圖同)圖2 Wnt4基因沉默后腎組織中Wnt4 mRNA相對表達量Note. b1: The UUO and the negative silencing groups were compared with the sham operation group, respectively, P< 0.05. b2 and b3: The silencing group compared with the UUO and negative silencing groups, P < 0.05.(The same in the following figures)Figure 2 Relative expression of Wnt4 mRNA in the renal tissues after Wnt4 silencing

2.3 Wnt4基因沉默后β-catenin mRNA相對表達量

假手術組β-cateninmRNA的表達量在四個時間點無明顯變化；UUO組、陰性組及沉默組β-cateninmRNA的表達量隨著梗阻時間延長增加，明顯高于同一時間點的正常組(P< 0.05)，且三組間表達量無統(tǒng)計學差異。(見圖3)

2.4 Wnt4基因沉默后α-SMA mRNA相對表達量

假手術組α-SMAmRNA表達量在四個時間點無明顯差別；UUO組及陰性組α-SMAmRNA表達量隨著梗阻時間延長增加，明顯高于同一時間點的假手術組(P< 0.05)。沉默組的α-SMAmRNA表達量隨著梗阻時間延長減少，第10、14天時與同一時間點的UUO組及陰性沉默組相比明顯減少(P< 0.05)，但仍明顯高于同一時間點的假手術組(圖4)。

圖3 Wnt4基因沉默后β-catenin mRNA相對表達量Figure 3 Relative expression of β-catenin mRNA in the renal tissues after Wnt4 gene silencing

圖4 Wnt4基因沉默后α-SMA mRNA相對表達量Figure 4 Relative expression of α-SMA mRNA in the renal tissues after Wnt4 silencing

2.5 Wnt4基因沉默后波形蛋白(vimentin)mRNA相對表達量

假手術組的vimentinmRNA表達量在四個時間點無明顯差異；UUO組及陰性沉默組vimentinmRNA表達量隨著梗阻時間延長增加，明顯高于同一時間點的假手術組(P< 0.05)。沉默組vimentinmRNA表達量隨著梗阻時間延長增加，第14天時表達量減少，明顯低于同一時間點的UUO組及陰性沉默組(P< 0.05)，但較同一時間點的假手術組表達量仍高(P< 0.05)(見圖5)。

圖5 Wnt4基因沉默后波形蛋白(vimentin)mRNA相對表達量Figure 5 Relative expression of vimentin mRNA after Wnt4 silencing

注：A、B,UUO組; C、D，沉默組。圖6 Wnt4基因沉默后Wnt4與β-catenin、α-SMA相關性分析Note.A、B,UUO group. C、D，Silencing group.Figure 6 Correlation between the expressions of Wnt4 and β-catenin and α-SMA after Wnt4 gene silencing

2.6 Wnt4基因沉默后Wnt4與β-catenin、α-SMA相關性分析

Wnt4基因沉默后UUO組 mRNA表達量的相關性分析顯示，Wnt4與β-cateninmRNA表達量具有顯著相關性(r=0.886，P< 0.001)(圖6A)。Wnt4與α-SMAmRNA表達量具有顯著相關性(r=0.930，P< 0.001)(圖6B)。Wnt4基因沉默后沉默組mRNA表達量的相關性分析顯示，Wnt4與β-cateninmRNA表達量無顯著相關性(r=0.204，P=0.263)(圖6C)。Wnt4與α-SMAmRNA表達量具有顯著相關性(r=0.753，P< 0.001)(見圖6D)。

3 討論

腎間質纖維化是臨床慢性腎病治療和腎移植管理的關鍵，但至今RIF的發(fā)病機制還不甚明了，對抗腎間質纖維化的治療，尚無有效的方案。本研究前期實驗證明Wnt/β-catenin信號通路在腎間質纖維化中起到重要作用，信號通路阻斷可減少腎間質纖維化發(fā)生。Wnt信號傳導通路分為經典Wnt/β-catenin 信號通路及非經典信號轉導通路，后者包括Wnt/Ca2+通路和細胞極性通路[1]，當腎損傷時，Wnt4基因大量表達，與跨膜結合并形成復合物，抑制細胞內GSK-3β表水平達，阻止β-連環(huán)蛋白磷酸化及降解，導致細胞內β-連環(huán)蛋白大量聚集，進入細胞核中與轉錄因子LEF/TCF 結合，激活下游與EMT密切相關的靶基因，包括Snail,TwistT和鋅指蛋白(zinc finger E-box binding protein, ZEB)，三者均可在抑制上皮細胞鈣粘蛋白的同時激活間充質基因，包括N-鈣粘蛋白、波形蛋白和粘連蛋白[2-3]。在腎發(fā)育的不同階段，多種Wnt蛋白在腎不同部位均有不同程度的表達。國內外大量的基因敲除模型及體外研究證實，WNT蛋白介導的信號通路在腎的發(fā)育過程中必不可少，在腎發(fā)育的早期，Wnt4主要表達腹側間充質帽(CM)中，介導間充質-上皮轉分化，是唯一在腎前體細胞表達并表現(xiàn)出在腎發(fā)育過程中有重要作用的Wnt基因[4]。關于Wnt4誘導MET發(fā)生的機制，2011年，Tanigawa等[5]用重組WNT蛋白作為大鼠后腎間充質的祖細胞，研究發(fā)現(xiàn)WNT4 蛋白能夠誘導腎小管的形成。2013年，李里等[6]應用脂質體介導將重組質粒pEGFP-PAX2轉染入體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)PAX2轉染至腎小管上皮細胞后激活了Wnt4 通路，PAX2在體外誘導正常腎小管上皮細胞間充質轉分化可能是通過 Wnt/β-catenin通路完成。綜上所述，Wnt4基因和β-catenin基因及其編碼的蛋白在Wnt/β-catenin信號通路對EMT的調控中發(fā)揮重要作用。

本研究成功制作UUO大鼠RIF 模型，并通過慢病毒轉染成功將Wnt4-siRNA片段導入UUO 大鼠體內，同時應用Real-Time PCR 進行檢測，結果顯示各時間點Wnt4 基因沉默組與陰性對照組比較，Wnt4 mRNA 和蛋白表達量明顯降低，提示Wnt4基因被沉默。在UUO模型中，Wnt4基因隨著梗阻時間延長表達量增加明顯，與轉分化指標α-SMA的表達量呈顯著正相關(r=0.930，P< 0.01)，纖維化指標波形蛋白梗阻后表達量增加，且腎病理提示腎間質膠原纖維堆積，纖維化形成，證實Wnt4基因被大量激活后，參與腎小管上皮間質轉分化過程，促進腎間質纖維化形成。β-連環(huán)蛋白在梗阻后第7天表達量明顯增多，明顯高于同期的假手術組，且Wnt4與β-catenin的mRNA相對表達量呈顯著正相關(r=0.886，P< 0.001)，說明Wnt4沉默后，主要通過Wnt4/β-catenin信號通路傳導信號，誘導腎小管上皮間質轉分化的發(fā)生。沉默組的β-cateninmRNA的表達量隨著梗阻時間的延長表達量增加，與同一時間點的UUO組及陰性組無統(tǒng)計學差異。且相關性分析結果顯示Wnt4與β-catenin無顯著相關性(r=0.204，P=0.263)，提示Wnt4基因沉默后，可能會代償性地激活其他信號通路，導致β-catenin的表達量上調。在轉染10 d 時，靶基因沉默組α-SMAmRNA 表達量明顯低于陰性對照組。說明Wnt4基因沉默在纖維化進程中對EMT 有影響，在纖維化進程中可明顯抑制腎小管EMT的過程，延緩RIF的進程。本研究顯示在UUO模型中β-連環(huán)蛋白在梗阻后第7天表達量明顯增多，明顯高于同期的正常組，且Wnt4與β-catenin的mRNA相對表達量呈顯著正相關(r=0.886，P< 0.001)，說明Wnt4基因激活后，主要通過Wnt4/β-catenin信號通路傳導信號，誘導腎小管上皮間質轉分化的發(fā)生。

Wnt信號轉導的研究還處于探索階段，有許多問題尚不清楚。本研究通過沉默Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt4基因，觀察了腎間質纖維化的改變，發(fā)現(xiàn)沉默Wnt4 基因后腎間質纖維化減少。腎間質纖維化是由多因素導致、多基因參與、多步驟形成的復雜病理生理過程。選擇合適的藥物和有效的治療手段對于慢性腎病患者至關重要。綜上所述，本研究為慢性腎病的藥物研發(fā)及治療靶點提供了一定的理論依據。