高琴琴，丁子桐，李友林，史 琦，苗 豐，石 璐，楚慧倫，孔德明，孫文燕*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 102488；2. 中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病二部，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(肺病慢性咳喘)，中醫(yī)藥防治過敏性疾病北京市重點實驗室(BZ0321)，中日友好醫(yī)院呼吸中心；國家呼吸疾病臨床研究中心，北京 100029)

支氣管哮喘是由多種炎性細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是常見的慢性呼吸道疾病之一。該病嚴重威脅人們健康，且目前尚缺乏根治藥物。動物模型是藥物評價的重要工具，卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏激發(fā)法是最常用的建立模型方法，但造模劑量不盡一致。許多哮喘模型OVA致敏劑量多在10～100 μg不等，其中以20、50、100 μg最為常見，但國內外對不同致敏劑量的造模小鼠進行對比的研究很少，且關于最佳OVA致敏劑量并無明確的報道。本研究基于文獻[1-3]，采用常用的三種劑量(20、50、100 μg)OVA復制BALB/c小鼠哮喘模型，通過觀察血清IgE、IL-4、IFN-γ的含量、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)嗜酸性粒細胞(eosinophils，EOS)數(shù)量及肺組織病理變化情況，以探索較為合適的OVA劑量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級6～8周齡BALB/c小鼠50只，體重18～20 g，雌雄各半，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供[SCXK(京)2016-0002]。動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院屏障環(huán)境中[SYXK(京)2016-0043]，溫度22℃～24℃，濕度44%～50%。本實驗方案經(jīng)過中日友好醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審查，符合動物保護、動物福利和倫理原則，符合國家實驗動物福利倫理相關規(guī)定，審查編號： 180105。本實驗實施過程中嚴格遵守動物使用的 3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白，北京博奧森生物技術有限公司，批號AH06C17666；4%氫氧化鋁凝膠，Thermo公司，批號：SH255260；醋酸地塞米松，天津力生制藥股份有限公司，批號：1705021；小鼠IgE、IL-4、IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒，聯(lián)科生物。

402B型超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司；Multiskan MK3全自動多功能酶標儀，Thermo公司，USA；DH4000 A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

隨機將動物分為5組，即正常組，模型1組(OVA 20 μg)，模型2組(OVA 50 μg)，模型3組(OVA 100 μg)，醋酸地塞米松組(OVA 100 μg)，每組10只，雌雄各半。

1.3.2 哮喘模型的復制

BALB/c小鼠適應性飼養(yǎng)一周，采用OVA和氫氧化鋁凝膠腹腔注射及OVA霧化激發(fā)方法建立支氣管哮喘模型。具體方法及時間節(jié)點見表1。

在第22～28天，各模型組與醋酸地塞米松組每天霧化吸入1% OVA 30 min，正常組每天霧化吸入生理鹽水30 min。醋酸地塞米松組在霧化前1 h灌胃給藥醋酸地塞米松(0.5 mg/kg)，其余各組灌胃生理鹽水。

表1 BALB/c小鼠支氣管哮喘模型建立方法(n=10)

1.3.3 血清IgE、IL-4、IFN-γ的含量測定

第29天，各組小鼠眼球取血，3000 r/min 離心 10 min，取血清，采用ELISA法檢測血清中IgE、IL-4、IFN-γ的含量。實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)EOS計數(shù)

鈍性分離頸部組織，暴露氣管，在氣管上剪一個T型小口，插入靜脈留置針軟管，用注射器注入0.8 mL生理鹽水，重復3次。將收集到的BALF 2500 r/min離心5 min，將沉淀涂片，進行瑞氏染色，高倍鏡下計數(shù)EOS。

1.3.5 肺組織病理學觀察

取小鼠右肺，福爾馬林固定24 h，脫水后石蠟包埋、切片、HE染色。每組隨機選取6只，在光學顯微鏡下(200倍)觀察小鼠肺組織的病理變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

對模型3組、醋酸地塞米松組進行兩組間差異性比較：若服從正態(tài)分布且方差齊采用t檢驗；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

BALB/c 小鼠在致敏時無顯著特征，經(jīng)卵蛋白激發(fā)后出現(xiàn)呼吸急促、弓背直立、躁動撓鼻、二便失禁等典型表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ含量比較

與正常組比較，模型1、2、3組小鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IL-4/IFN-γ比值顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型3組比較，醋酸地塞米松組血清IgE、IFN-γ含量明顯下降(P<0.05)，IL-4/IFN-γ比值顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞計數(shù)

與正常組比較，模型1、2、3組小鼠BALF中EOS數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型3組相比，醋酸潑尼松組BALF中EOS數(shù)有下降趨勢(P>0.05)。見表3。

2.4 肺組織病理學觀察

三種不同劑量的卵蛋白均可造成小鼠肺組織炎細胞浸潤、淋巴濾泡形成、支氣管上皮細胞變性、支氣管平滑肌增生等病理損害。模型2組(OVA 50 μg)較模型1組(OVA 20 μg)、3組(OVA 100 μg)支氣管平滑肌增生及黏膜皺襞損傷更為嚴重。醋酸地塞米松組較模型3組上述病理損害明顯減輕。見表4，圖1。

表2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ含量及IL-4/IFN-γ比值比較

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型3組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,△P<0.05，△△P<0.01. Compared with the model 3 group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 各組小鼠BALF中EOS數(shù)量比較

注：與正常組比較，△P<0.05.

Note. Compared with the normal group,△P<0.05.

表4 各組小鼠肺組織病理變化比較

3 討論

哮喘的發(fā)病機制復雜，動物模型的不斷研究及優(yōu)化為進一步研究其發(fā)病機制提供客觀有效的手段。目前用于制作哮喘模型的動物多采用BALB/c小鼠[3]，常用的模型制備方法是采用OVA和氫氧化鋁致敏及OVA霧化吸入激發(fā)，但采用OVA制作哮喘模型的方法存在很大的差異，致敏劑量多在10～100 μg不等，國內外關于最佳OVA致敏劑量并無明確的報道，綜合近五年的文獻，多使用20、50、100 μg的OVA進行致敏。如房祥峰[4]，劉家齊等[5]采用20 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠；張明強[2]，劉瑞等[6]采用50 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠；程勝[3]，謝林艷等[7]采用100 μg OVA輔以氫氧化鋁致敏小鼠。

本研究基于上述等近年來的文獻分析，選用三種劑量的OVA進行致敏激發(fā)。隨著IgE和嗜酸性粒細胞數(shù)的升高，導致氣道管腔狹窄，支氣管平滑肌增生，氣道上皮細胞變性，支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生并分泌大量黏液，使得平滑肌的敏感性增高，導致氣道高反應性，從而引起肺組織病理改變以及呼吸急促、躁動撓鼻、二便失禁等癥狀。因此，哮喘模型的成功主要從小鼠的癥狀、嗜酸性粒細胞數(shù)、氣道病理改變以及血清IgE、IL-4、IFN-γ含量變化等幾個方面來評價，以此來評估哮喘發(fā)病過程中的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性，從而探索較為合適的OVA劑量。

IgE可介導Ⅰ型超敏反應，使嗜堿性粒細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放多種炎癥介質加重哮喘炎癥反應[5]。本研究結果顯示三組哮喘模型小鼠血清中IgE均明顯升高；而陽性藥醋酸地塞米松組與模型3組相比，IgE水平降低，表明其可降低IgE介導的變態(tài)反應。

炎癥反應在哮喘發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用，EOS作為哮喘中氣道炎癥、超敏反應及組織損傷等病理過程的主要效應細胞，參與哮喘的炎癥過程[8]。本研究收集BALF并檢測其中EOS，發(fā)現(xiàn)模型1、2、3組哮喘模型小鼠EOS較正常組升高。

輔助性T細胞亞群Th2的免疫增強在哮喘的發(fā)生、發(fā)展起著主導作用[9]。Th2主要分泌IL-4、IL-5等細胞因子，而Th1主要分泌IL-2、INF-γ等細胞因子。本研究中3個模型組較正常組IL-4均顯著升高。經(jīng)典理論認為Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的關鍵機制，但近年來較多研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病機制已不能單純用Th1/Th2平衡理論來解釋。研究者用特異性抗原在體外分離哮喘患兒外周血單個核細胞，檢測發(fā)現(xiàn)上清液中IFN-γ和IL-4水平均增高，提示哮喘患兒體內Th1和Th2細胞功能均增強；而且在哮喘緩解期患者外周血中淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ較特應癥患者及正常人明顯增多[10]。本研究中以IFN-γ為代表的Th1細胞因子顯著升高，與上述結果一致。因此，不能只考慮用Th1/Th2平衡理論來解釋哮喘的發(fā)病機制，需要進行更多的探索完善，近年來研究較多的有Th17/Treg平衡、TGF-/TrSmads[11]及VEGF/MMP[12]信號通路等。

組織形態(tài)學是評價哮喘模型是否成功的重要指標[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個模型組的肺組織病理切片可見大量的炎性細胞浸潤，支氣管管腔內可見黏液栓，上皮細胞變性，黏膜皺襞改變及支氣管平滑肌增生等表現(xiàn)，與哮喘患者的病理特征相似；模型2組(50 μg)BALB/c小鼠較模型1組(20 μg)、模型3組(100 μg)在支氣管平滑肌增生及黏膜皺襞變化方面更為顯著。

綜上所述，本研究采用三種劑量OVA誘導的BALB/c小鼠哮喘模型均獲成功，但綜合而言50 μg OVA所誘發(fā)的哮喘模型血清IgE、IL-4、IFN-γ含量以及肺組織病理改變更為明顯，可用于哮喘相關的實驗研究。醋酸地塞米松可減少IgE分泌、降低血清炎性細胞因子含量，減輕肺組織病理變化，可作為陽性藥使用。