酈錚錚，孫洪偉，張楠，蘇華芳

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.神經(jīng)內科；2.肝膽外科；3.放化療科）

外泌體是一類由多種類型活細胞分泌的，直徑為30～100 nm的囊泡小體，含有許多生物活性物質，如蛋白質、mRNA、miRNA、DNA片段等[1-3]。這些生物活性物質可在細胞間相互傳遞，進而調節(jié)細胞的功能。近年來，外泌體在腫瘤微環(huán)境中的調控作用受到越來越多的關注。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞來源的外泌體能夠通過促進腫瘤血管新生[4]、誘導腫瘤相關成纖維細胞的分化[5]、參與腫瘤微環(huán)境中的免疫調控促進腫瘤的免疫逃逸[6]、塑造未來轉移靶器官的微環(huán)境以實現(xiàn)自身轉移[7]等多種方式，調控腫瘤微環(huán)境，進而促進腫瘤的進展。

腫瘤血管生成是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，在腫瘤的進展中發(fā)揮著關鍵作用。目前已有很多研究證實，外泌體能通過不同的途徑參與腫瘤血管的生成。如來源于人類白血病腫瘤細胞的外泌體傳遞的miRNA被臍靜脈內皮細胞攝取后，可導致腫瘤細胞遷移的增多和血管管腔的形成[8]。另外惡性黑色素瘤細胞來源的外泌體內含有miR-9，其被內皮細胞攝取后可以通過激活JAK-STAT通路來促進血管生成[9]。但有研究提示腫瘤在發(fā)展過程中在促進血管新生的同時，也伴隨著原有及新生血管的破壞。STRILIC等[10]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞通過激活內皮細胞表面的死亡受體6（death receptor 6，DR6）導致血管內皮細胞的凋亡從而發(fā)生遠處轉移，使用RIPK1抑制劑necrostatin-1，或特異性敲除小鼠內皮RIPK3明顯抑制腫瘤細胞的這種作用并使轉移發(fā)生率明顯下降。另外具有轉移能力的乳腺癌腫瘤外泌體中的miR-105特異性抑制血管內皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1表達，進而摧毀血管內皮屏障來促進轉移前微環(huán)境的形成[11]。腫瘤外泌體是否通過其他的機制破壞血管完整性目前仍不得而知。本研究觀察膽管細胞癌來源外泌體對內皮細胞緊密連接蛋白，以及對體內血管通透性的影響，并進一步探討其可能的機制，為臨床防治腫瘤轉移提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基及高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Corning公司，ECM培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，血清替代物購自美國Stembo公司；PKH26、70 kDa FITC標記的右旋糖酐購自美國Sigma公司；ZO-1（21773-1-AP，1∶1 000稀釋）、ATF6（66563-1-Ig，1∶1 000稀釋）抗體購自美國Proteintech公司，CD9（1∶1 000稀釋）、CLDN5（ab15106，1∶1 000稀釋）、eIF2α（ab169528，1∶1 000稀釋）、磷酸化eIF2α（ab32157，1∶1 000稀釋）抗體購自美國Abcam公司，PERK（5683，1∶1 000稀釋）、IRE-1α（3294，1∶1 000稀釋）購自美國CST公司，Alix（sc-49268，1∶1 000稀釋）、CD81（sc-7637，1∶1 000稀釋）、β-actin（sc-69879，1∶4 000稀釋）購自美國Santa Cruz公司；5×PrimerScript RT Master Mix，SYBR Green PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 外泌體分離和鑒定 人膽管細胞癌細胞系CCLP和人膽管上皮細胞系HIBEC接種于10 cm皿中，分別使用含10% Stembo血清替代物的RPMI 1640培養(yǎng)基及高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集上清，300×g離心10 min，2 000×g離心10 min，10 000×g離心30 min去除所有的細胞及細胞碎片。隨后上清在10 kDa分子截流中空纖維膜濃縮管中以2 500×g濃縮10 min。上述上清于0.22 μm濾器過濾除菌后以110 000×g超速離心70 min，PBS洗滌1次并再次以110 000×g超速離心70 min。BCA法檢測蛋白濃度，Nanosight檢測外泌體粒徑分布，透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)，蛋白電泳檢測Alix、CD9、CD81的表達。為檢測內皮細胞內吞外泌體，使用PKH26對外泌體進行染色，細胞內吞12 h后固定，鬼筆環(huán)肽細胞骨架染色并于激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）分離、分組及處理 收集2017年11月至2017年12月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科棄用的健康新生兒臍帶3例（已通過本院倫理委員會審查，所有產(chǎn)婦均充分知情并簽署知情同意書）。PBS沖洗殘留血液，1 mg/mL I型膠原酶37 ℃消化臍靜脈內腔30 min，隨后予含10% FBS的M199終止反應。收集消化液400×g離心5 min，PBS清洗1次并予含10% FBS的ECM重懸，接種于T25培養(yǎng)瓶中。24 h后更換全部培養(yǎng)基。所有實驗均使用第3～第6代HUVEC。HUVEC分為PBS、exoHIBEC及exoCCLP3組，分別使用PBS、5 μg/mL HIBEC外泌體（exoHIBEC）和5 μg/mL CCLP外泌體（exoCCLP）處理48 h并進行相關檢測。

1.4 內皮細胞層通透性檢測 HUVEC鋪被于0.4 μm孔徑transwell的上室中并充分生長至融合，同時予PBS、5 μg/mL exoHIBEC及5 μg/mL exoCCLP處理48 h。隨后于上室中加入10 mg/mL 70 kDa FITC標記的右旋糖酐，分別于10 min、30 min及60 min吸出下室中的培養(yǎng)基50 μL，并于多功能酶標儀中檢測OD值（488 nm激發(fā)波長，520 nm發(fā)射波長）。

1.5 免疫熒光 細胞鋪被于載玻片上予PBS、5 μg/mL exoHIBEC或5 μg/mL exoCCLP處理并生長至融合，予預冷丙酮固定10 min，PBS洗3次，5% BSA封閉15 min，一抗4 ℃孵育過夜（ZO-1，21773-1-AP，1∶100稀釋；CLDN5，ab15106，1∶100稀釋）。Alexa Fluor?488熒光二抗（1∶400稀釋）室溫避光孵育1 h，DAPI（1∶5 000稀釋）染核并予熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

1.6 Western blot檢測 經(jīng)外泌體處理后的細胞予PBS洗1次，冰上RIPA裂解30 min。裂解液4 ℃12 000×g離心15 min收集上清。予BCA定量蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳及轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗（稀釋度參照前述）4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，BioRad凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.7 實時定量PCR檢測 經(jīng)外泌體處理后的細胞予TRIzol裂解提取總RNA，分光光度計檢測RNA濃度。取1 μg總RNA使用5×PrimerScript RT Master Mix反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，進一步使用SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR。引物序列參照表1，以GAPDH作為測定內參。

1.8 動物模型建立與處理 實驗選擇雄性BALB/c裸鼠（6～8周），實驗動物許可證號SCXK（蘇）2015-0001。實驗動物隨機分為PBS組、exoHIBEC組、exoCCLP組，上述動物每周3次尾靜脈注射PBS、20 μg exoHIBEC或20 μg exoCCLP。血管滲漏模型：上述裸鼠注射4周PBS或相應外泌體后予尾靜脈注射100 mg/kg 70 kDa FITC標記的右旋糖酐并在1 h后處死小鼠，收集裸鼠肝臟及肺組織，予OCT包埋并制作冰凍切片。熒光顯微鏡觀察肝臟及肺組織切片中的右旋糖酐滲出情況。腫瘤轉移模型：上述裸鼠注射1周PBS或外泌體后尾靜脈注射5×106CCLP細胞。此后繼續(xù)上述處理方式至4周。裸鼠處死后收集肺組織，予制作石蠟切片并予HE染色。光鏡下觀察并計數(shù)肺部轉移瘤數(shù)量。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett’s檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 CCLP外泌體的鑒定結果 應用經(jīng)典的超速離心法從CCLP細胞上清中提取到的物質行粒徑分析，結果顯示其粒徑分布集中在170 nm左右（見圖1A）。電鏡結果提示具有典型的“杯口”樣形態(tài)（見圖1B）。Western blot結果提示獲得的沉淀表達CD9、CD81及Alix（見圖1C）。通過PKH26染色使外泌體膜成分著紅色熒光，并予HUVEC內吞12 h。激光共聚焦顯微鏡提示HUVEC能夠內吞外泌體（見圖1D）。以上結果表明通過超速離心法提取的物質的確為外泌體，并且外泌體能夠被HUVEC攝取。

圖1 外泌體鑒定和HUVEC對外泌體的內吞作用

2.2 CCLP外泌體破壞血管內皮細胞的緊密連接與PBS組比，exoCCLP明顯抑制HUVEC緊密連接蛋白ZO-1及CLDN5的表達（P＜0.05）（見圖2A-B）。免疫熒光提示經(jīng)exoCCLP處理后的HUVEC其ZO-1失去完整性，在細胞連接處呈現(xiàn)點狀分布，而CLDN5在內皮細胞中僅呈片狀表達。PBS及exoHIBEC不影響HUVEC ZO-1及CLDN5表達（見圖2C）。內皮細胞通透性實驗提示經(jīng)exoCCLP作用后，上室中FITC標記的右旋糖酐滲漏入下室較PBS及exoHIBEC處理組明顯增多（P＜0.05）（見圖2D-E），提示exoCCLP使HUVEC單細胞層的通透性明顯增加。以上結果表明CCLP來源的外泌體能夠抑制內皮細胞緊密連接蛋白的表達，增加血管的通透性。

2.3 CCLP外泌體在體內增加血管通透性 與PBS及exoHIBEC相比，尾靜脈注射exoCCLP4周后明顯增加裸鼠肺部（見圖3A）及肝臟（見圖3B）內的FITC-右旋糖酐的滲出。另外在持續(xù)接受PBS、exoHIBEC、exoCCLP尾靜脈注射的裸鼠中注射CCLP細胞，肺組織切片HE染色提示exoCCLP處理組腫瘤灶數(shù)量明顯增多（見圖3C）。以上結果表明CCLP在體內能夠增加血管的通透性并促進腫瘤的轉移。

2.4 CCLP外泌體引起血管內皮細胞內質網(wǎng)應激導致內皮細胞緊密連接蛋白下降 HUVEC經(jīng)exoCCLP作用不同時間段后Western blot及PCR檢測內質網(wǎng)應激相關指標。與PBS及exoHIBEC相比，exoCCLP提高HUVEC內質網(wǎng)應激相關基因如XBP1、ATF6、PPP1R15A等（見圖4A），增加內質網(wǎng)應激相關蛋白如IRE1α、ATF4的表達，并促進PERK及其下游eIF2α的磷酸化（見圖4B）。通過小干擾RNA分別下調HUVEC ATF6、IRE1α或PERK后再加入exoCCLP作用48 h，Western blot檢測緊密連接蛋白。結果提示PERK及IRE1α敲減能夠改善exoCCLP對內皮細胞緊密連接蛋白的下調作用（見圖4C）。這些結果表明CCLP來源的外泌體能夠通過引起內皮細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激導致緊密連接蛋白下調。

圖2 CCLP外泌體體外破壞血管內皮細胞層緊密連接并增加其通透性

3 討論

腫瘤血管生成是腫瘤微環(huán)境一個重要的特征，在腫瘤的進展中發(fā)揮著關鍵作用。目前已有很多研究證實，外泌體能通過不同的途徑參與腫瘤血管的生成[12-14]。但最近的研究顯示腫瘤在發(fā)展過程中在促進血管新生的同時，也伴隨著原有及新生血管的破壞[10-11，15-16]。緊密連接蛋白直接調控著內皮細胞與上皮細胞的通透性。而脫落的腫瘤發(fā)生轉移的重要一步就是與內皮層相互作用并穿透內皮屏障[17]。因此緊密連接蛋白成為腫瘤發(fā)生轉移前必須攻克的第一道屏障。我們的研究結果表明膽管細胞癌來源的外泌體能夠下調內皮細胞ZO-1、CLDN5的蛋白水平。因此證明該腫瘤來源的外泌體能夠破壞血管屏障功能，增加血管的通透性。

圖3 CCLP外泌體在體內增加血管通透性并促進腫瘤轉移

未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號通路由3種定位于內質網(wǎng)上的跨膜蛋白IRE1、PERK和ATF6所始動[18]。通常情況下這3種內質網(wǎng)應激的感受器通過與免疫球蛋白重鏈結合蛋白（BiP/GRP78）結合而處于非激活狀態(tài)。當內質網(wǎng)腔內的未折疊蛋白堆積時，BiP脫落并進一步活化未折疊蛋白信號通路。這種適應性的細胞反應通過磷酸化eIF2α下調細胞蛋白合成水平，并通過轉錄活化XBP-1及ATF6增強內質網(wǎng)的蛋白折疊能力及異常折疊蛋白降解能力，恢復細胞內蛋白折疊的穩(wěn)態(tài)[19-21]。我們的實驗觀察到HUVEC經(jīng)exoCCLP處理后PERK、eIF2α磷酸化增強，總IRE1α、ATF4表達增加，其下游拼接型態(tài)XBP1 mRNA水平增加，我們也觀察到多種內質網(wǎng)相關的基因如DDIT3、PPP1R15A增加，提示exoCCLP引起HUVEC的內質網(wǎng)應激反應。

內質網(wǎng)應激增加PERK激酶的活性，引起eIF2α磷酸化，從而導致翻譯停滯及活化下游信號通路，引起全面性細胞蛋白合成和增殖停滯[22]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)內皮細胞的緊密連接蛋白ZO-1及CLDN5明顯下調。通過小干擾RNA敲減HUVEC的ATF6、PERK或者IRE1α水平，我們發(fā)現(xiàn)HUVEC細胞PERK或者IRE1α水平下調能夠逆轉exoCCLP引起的緊密連接蛋白表達抑制，而敲減ATF6并無此作用。上述結果提示：①exoCCLP通過內質網(wǎng)應激引起內皮細胞緊密連接蛋白下調；②在內質網(wǎng)應激3條通路中，exoCCLP主要通過PERK和IRE1α通路引起緊密連接蛋白下調。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中存在持續(xù)內質網(wǎng)應激反應，但缺乏IRE1α的激活并缺乏其下游拼接型XBP1，導致胰腺癌細胞的免疫抵抗及轉移[23]。因此其他腫瘤細胞中無法緩解的內質網(wǎng)應激可能是普遍存在的。我們推測未折疊蛋白在腫瘤細胞內堆積，無法通過未折疊蛋白反應清除，因此可能經(jīng)過外泌體包裝被分泌到周邊細胞中，引起周邊正常細胞的內質網(wǎng)應激反應。另外，研究顯示哺乳動物細胞中存在另一種非常規(guī)的內質網(wǎng)應激激活方式：細胞內異常飽和度的脂質雙分子層能夠通過激活PERK及IRE1α的跨膜段而非內質網(wǎng)腔內段引起內質網(wǎng)應激[24]。而外泌體是一類由脂質雙分子層包裹的囊泡小體，在腫瘤包裝和分泌的過程中可能破壞其脂質飽和度，引起受體細胞的PERK及IRE1α的跨膜段激活而誘發(fā)內質網(wǎng)應激。但上述推測需要研究進一步證實。

圖4 CCLP外泌體激活內皮細胞內質網(wǎng)應激通路

綜上所述，膽管細胞癌來源的外泌體能夠通過引起內皮細胞內質網(wǎng)應激抑制緊密連接蛋白表達，破壞血管內皮屏障的完整性從而利于轉移的發(fā)生。