韓玉 吳堯 王林

摘 要：該文總結(jié)了稻瘟病菌的分離方法、適合產(chǎn)孢的培養(yǎng)基、溫度和pH、保存方法以及主要防治技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為稻瘟病菌生理小種的鑒定和治病機(jī)理的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；分離方法；保存方法；防治方法

中圖分類號 S435 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）07-0057-03

Abstract：According to the research progress，the isolation methods of Magnaporthe oryzae，the medium suitable for sporulation，temperature and pH，the preservation methods，and the main control methods were summarized，in order to lay the foundation for the identification and treatment mechanism of the pHysiological race of Magnaporthe oryzae，and to improve the quality of rice as a reference.

Key words：Magnaporthe oryzae；Separation method；Preservation method；Control method

稻瘟病是水稻主要病害之一，易造成水稻的大面積減產(chǎn)，它是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；無性態(tài)為稻梨孢菌：Pyricularia oryzae）引起[1]，產(chǎn)生的孢子通過風(fēng)、雨水、病殘體等傳播[2]，一旦遇到合適的氣候條件，易大面積暴發(fā)，造成嚴(yán)重危害。目前，對稻瘟病病菌生理機(jī)制的研究需要在室內(nèi)人工環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。多年來，不同科研工作者對適合稻瘟病菌培養(yǎng)方法及條件等進(jìn)行了深入研究，得到了大量試驗結(jié)果。本文根據(jù)文獻(xiàn)報道以及部分結(jié)果實驗，對稻瘟病菌產(chǎn)孢技術(shù)和防治技術(shù)做以下總結(jié)概述。

1 稻瘟病菌單孢分離方法

稻瘟病菌分離方法多種多樣，主要有直接挑單孢法、罹病組織分離法、稀釋法等，但運用最多的還是參照高坂淖爾等[3]提出的挑菌法。分離出單一的稻瘟病菌是培養(yǎng)的關(guān)鍵，為后期回接鑒定提供了基礎(chǔ)保障。

1.1 挑菌法 裝置的制備：用硬紙制作一個圓形的擱物臺（正好可以套在聚光鏡鏡頭上，直徑2.3cm，高度2.0cm），在擱物臺的上部剪1個小口，可以讓稻節(jié)固定。在樣品夾的右部分粘上1塊兩面膠，寬度和長度正好可以將1塊橡皮固定住，將針灸針末端減去后插在橡皮中部，整個挑菌裝置制作完成。具體操作：將采集的病稻節(jié)用自來水沖洗干凈，然后置于鋪有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)2d左右。將病稻節(jié)放在制作的擱物臺上，先移動載物臺使接種針移到視野中央，通過細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使接種針清晰成像，然后將針灸針移到視野外；接著再用調(diào)節(jié)旋鈕上下調(diào)整使稻節(jié)上的孢子在目鏡中能清晰成像，此時將針灸針慢慢靠近病稻節(jié)，在目鏡下挑取單孢。最后用接種針取一小塊固體培養(yǎng)基蘸取單孢，置于平板中央培養(yǎng)。這種操作過程需在超凈工作臺中完成。這種方法分離單孢精確，但是操作難度大，需要技巧和熟練，分離效率50%～70%。

1.2 罹病組織分離法[4] 將采集的病稻節(jié)先用75%酒精消毒30s后，用自來水沖洗干凈，然后按照挑菌法一樣保濕培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后的病稻節(jié)上面產(chǎn)生大量孢子，用無菌鑷子夾取病稻節(jié)，然后在培養(yǎng)基平板上輕敲3～4下，此時解剖鏡下觀察單孢的有無及數(shù)量。這種分離方法操作簡單，但是產(chǎn)生的單孢可能不是同一生理小種，不能分離出純稻瘟病菌株，對后期的實驗結(jié)果影響很大。而且這種方法在敲落孢子的過程中污染幾率大。

2 稻瘟病菌分離培養(yǎng)基

適合稻瘟病菌生長和產(chǎn)孢的培養(yǎng)基種類豐富，其組成成分也千差萬別。在生理小種鑒別試驗中，前期需要在實驗室培養(yǎng)中篩選合適的培養(yǎng)基使病菌產(chǎn)孢量豐富，而產(chǎn)孢量低且存在其他問題的培養(yǎng)基會被淘汰，篩選最優(yōu)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基是實驗的關(guān)鍵。幾十年來，不同的研究者報道了許多適合稻瘟病產(chǎn)孢的培養(yǎng)基。

2.1 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基[5] 取200g馬鈴薯加水煮沸30min，用紗布過濾，補(bǔ)水至1000mL，然后加20g蔗糖攪拌均勻，平板培養(yǎng)基再加1%瓊脂。這種方法制作方便，成本低廉，產(chǎn)孢量相對適中，實際工作中應(yīng)用較為廣泛。

2.2 番茄燕麥培養(yǎng)基[6] 稱取燕麥片40g在水中煮沸10min，用雙層紗布過濾，番茄汁150mL，將2種汁液混合，再加水定容到1L，平板培養(yǎng)基再加1%瓊脂。這種方法產(chǎn)孢量合適，一般都能達(dá)到相應(yīng)的產(chǎn)孢量，而且成本低，是較為合適的培養(yǎng)基之一。

2.3 米糠培養(yǎng)基[7] 米糠50g在水中煮沸30min，用雙層紗布過濾，加入蔗糖25g，再加水定容到1L，平板培養(yǎng)基再加1%瓊脂。這種方法較為經(jīng)典，但是米糠含氮量低，其他營養(yǎng)價值也不高，所以產(chǎn)孢量低。根據(jù)許鳴一的研究報道，經(jīng)改良的3×米糠培養(yǎng)基使產(chǎn)孢量增加，但也存在因透明度低不適合觀察等缺點。

2.4 稻桿煎汁V8培養(yǎng)基[3] 將50g稻桿煮沸加水補(bǔ)充至750mL，V8液汁250mL，CaCO3 3g，瓊脂10g。這種方法產(chǎn)孢量優(yōu)于米糠培養(yǎng)基，但經(jīng)濟(jì)成本較高，實際生產(chǎn)中不適合使用。

2.5 稻秸浸出液+PDA培養(yǎng)基（1∶1）[8] 稻秸浸出液：稱取剪碎的稻秸30g，用1000mL清水浸泡16～24h；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，清水1000mL。這種方法在經(jīng)濟(jì)成本和來源難易程度上優(yōu)于番茄燕麥培養(yǎng)基，但是制作起來相對復(fù)雜一些。在實驗過程中，選擇什么樣的培養(yǎng)基供稻瘟病菌生長和產(chǎn)孢，還應(yīng)根據(jù)實驗需要以及材料的方便可取性。

3 稻瘟病菌適宜溫度和pH

根據(jù)文獻(xiàn)報道，28℃最適合稻瘟病菌的生長和產(chǎn)孢，其中16℃下雖能產(chǎn)孢，但病菌生長明顯滯后，這可能是由于溫度低限制了病菌生長所需的酶活性[9]，但后期恢復(fù)28℃，病菌仍能正常產(chǎn)孢。23℃產(chǎn)孢量少于28℃，但多于33℃。38℃病菌無法正常生長，但未完全失去活性[10]。

不同菌株對不同pH的變化反應(yīng)存在一定的差異，但是在pH5～7的范圍內(nèi)，菌株的生長速率基本不受影響，但就生長狀況而言，pH5時病菌生長狀況良好[10]。

4 稻瘟病菌保存方法

稻瘟病菌的保存過程至關(guān)重要，若保存不佳，容易出現(xiàn)雜菌污染、病菌失去活性等狀況，因此選擇合適的保存方法是整個實驗的重中之重。

4.1 濾紙片保存法[11] 將分離的菌株接種在平鋪有10張1cm×1cm無菌濾紙片的平板培養(yǎng)基上，待菌株長滿濾紙片，用鑷子夾取濾紙片放入無菌離心管中，干燥處理，待濾紙片完全干燥后將離心管蓋上蓋子放入-20℃冰箱中保存。這種方法操作簡單，不易造成污染，保存方便。

4.2 稻草節(jié)保存法 將稻節(jié)用粉碎機(jī)粉碎（粉碎成絲狀而非粉末狀的程度），置于滅菌鍋中121℃、45min滅菌，而后將其平鋪在平板培養(yǎng)基上，接種稻瘟病菌，待病菌長滿培養(yǎng)皿，將稻節(jié)轉(zhuǎn)移至離心管中，干燥處理后于-20℃冰箱中保存。這種方法的材料來源雖是病菌的寄主植物，但是后期培養(yǎng)易造成污染，稻節(jié)含有其他雜菌，保存難度大。

4.3 高粱粒保存法[11] 高粱粒在121℃、45min滅菌后烘干，取10粒平放在平板培養(yǎng)皿中部，接種稻瘟病菌，直至病菌長滿高粱粒，然后將高粱粒轉(zhuǎn)入離心管中，干燥后蓋上蓋子保存在-20℃冰箱中。這種方法容易造成其他雜菌的滋生，占用空間大。

5 稻瘟病防治技術(shù)

在稻瘟病易發(fā)區(qū)，其預(yù)防和防治工作每年必不可少，做好預(yù)報和預(yù)警以及防控，可以大大降低稻瘟病發(fā)生帶來的風(fēng)險。

5.1 積極宣傳，加強(qiáng)農(nóng)戶的防范意識[12] 在水稻種植區(qū)，要經(jīng)常培訓(xùn)，發(fā)放植保有關(guān)資料，提高農(nóng)民的防范意識和技術(shù)水平，一旦發(fā)現(xiàn)病情要及時上報，將風(fēng)險降到最低。

5.2 選用抗病品種[13] 隨著抗稻瘟病品種的普及與推廣，種植抗病品種是最佳選擇。但是應(yīng)杜絕長時間種植單一品種，使優(yōu)勢生理小種大面積擴(kuò)散，造成不可挽回的損失，所以要搭配使用抗病品種。

5.3 加強(qiáng)水肥管理[14] 在水稻種植前期，及時清理雜草、病稻節(jié)等，在水稻生長期，合理施肥，多施農(nóng)家肥，避免施單一肥；合理灌溉，確保水稻生長。

5.4 化學(xué)防治[15] 在稻瘟病發(fā)生的情況下，及時選擇合適的藥劑進(jìn)行噴藥防治，并避免使用單一藥劑，延緩抗藥性的產(chǎn)生。藥劑防治要避開水稻揚(yáng)花期。

5.5 生物防治 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，利用生物技術(shù)防治稻瘟病已屢見不鮮。研究表明，芽孢桿菌對防治稻瘟病中具有重要的作用[16]；布氏白僵菌對稻瘟病菌防治具有一定的抑制作用[17]；解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵濾液能明顯抑制稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)[18]；瑞香狼毒乙酸乙酯萃取物對稻瘟病菌有較強(qiáng)的抑制作用，它能抑制菌絲生長、孢子萌發(fā)和生長[19]；黃綠木霉菌發(fā)酵液對稻瘟病菌有抑菌和致菌死亡的作用[20]；灰黃霉素對稻瘟病菌的抑制效果與其濃度成正比[21]等。在生物防治稻瘟病的研究方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但是在實際生產(chǎn)應(yīng)用中還有待加強(qiáng)和推廣。

6 小結(jié)與展望

水稻是我國最主要的糧食作物之一，但稻瘟病菌每年都會對其造成嚴(yán)重危害。稻瘟病菌生理小種繁多且易變異對其研究需先了解其產(chǎn)孢特點及生物學(xué)特性，掌握治病機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，堅持綠色防治理念，通過科學(xué)的方法降低稻瘟病的發(fā)生幾率，確保水稻生產(chǎn)安全。

參考文獻(xiàn)

[1]楊勤忠，林菲，馮淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1601-1615.

[2]蘇柳.稻瘟病菌的致病性分析及水稻抗稻瘟病基因的定位[D].南昌：南昌大學(xué)，2016.

[3]高坂卓爾，山崎義人.稻瘟病和抗病育種[M].長春：東北師范大學(xué)出版社，1986：114-121.

[4]金曉春，李志新，張海生，等.稻瘟病菌分離及保存方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（17）：7308，7390.

[5]蘭波，李湘民，楊迎青，等.稻瘟病菌產(chǎn)孢技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，24（2）：74-76.

[6]張國珍，馬秋娟，彭友良.水稻稻瘟病菌有性世代形成條件的優(yōu)化[J].植物病理學(xué)報，2002，32（2）：121-126.

[7]阮洪椿，黃永康，陳如福，等.稻瘟病菌培養(yǎng)基篩選試驗[J].福建稻麥科技，2004，22（1）：31-32.

[8]吳斯駿，孫強(qiáng)，陳洪凡，等.一種稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的配制與效比分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（18）：118-120.

[9]唐力瓊，張玲，胡運高，等.稻瘟病菌生物學(xué)特性及產(chǎn)孢條件研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（6）：97-100.

[10]許鳴一.稻瘟病菌四種生理小種的形態(tài)和生長特性研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2011.

[11]趙沙沙，田永宏，余華強(qiáng)，等.稻瘟病菌孢子的分離和保存方法[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（24）：6252-6254.

[12]高云，顏培玲，宋小娟，等.水稻稻瘟病研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（8）：62-65.

[13]華麗霞，何煉，蔣秋平，等.稻瘟病抗性基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用進(jìn)展[J].分子植物育種，2016，14（10）：2739-2748.

[14]黃昆，戴世常.水稻稻瘟病發(fā)生情況及綜合防治現(xiàn)狀[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2018，38（8）：27，82.

[15]杜宜新，李科，阮宏椿，等.稻瘟病菌對稻瘟靈、異稻瘟凈和三環(huán)唑的敏感性[J].植物保護(hù)學(xué)報，2011，38（5）：455-460.

[16]沙月霞.防治稻瘟病芽孢桿菌的篩選及生防機(jī)制研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[17]何超.布氏白僵菌和黃綠僵菌對幾種植物病原菌的拮抗作用研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[18]王玉雙，肖蓉，郭照輝，等.來源于中藥的稻瘟病菌拮抗解淀粉芽孢桿菌鑒定及其活性成分特性[J].中國生物防治學(xué)報，2018，34（5）：746-752.

[19]梁海英.瑞香狼毒對稻瘟病菌的抑制活性及其機(jī)理的初步研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[20]林志偉，孫冬梅.黃綠木霉菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：180-182.

[21]張傳能，黃銘杰，毛寧.灰黃霉素對水稻稻瘟病菌的防治效果研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2015，31（4）：190-194.

（責(zé)編：張宏民）