沈世超 李俊卿 劉維信

摘 要：以具有肉質(zhì)根的未知白菜材料‘14-16及蕓薹種內(nèi)其他有/無肉質(zhì)根的類型為研究對(duì)象，利用分子標(biāo)記探究幾類蔬菜特別是具有肉質(zhì)根的‘14-16白菜材料與其他蕓薹種蔬菜的親緣關(guān)系。UPGMA 聚類結(jié)果表明：遺傳相似系數(shù)為0.62時(shí)，15份材料分為2類，第1類均為無肉質(zhì)根類型；‘14-16與有肉質(zhì)根的蕪菁和薹菜歸為第2大類，但親緣關(guān)系有一定距離。普通白菜‘黃渡矮青菜和大白菜‘北京新三號(hào)也屬于第2類，說明蕓薹種內(nèi)肉質(zhì)根類型材料的遺傳組成有一定的相似性，但也存在復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞：蕓薹種；肉質(zhì)根；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào) S634 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2019）07-0009-04

Abstract：In this study，the unknown material ‘14-16 with fleshy roots and other types of Brassica campestris L. with/without fleshy roots were used as research materials to explore the relationship between these vegetables，especially the ‘14-16 and other vegetables with fleshy root. The results of UPGMA clustering showed that when the genetic similarity coefficient was 0.62，15 materials were divided into two categories，and the first group was no fleshy root type；‘14-16 is classified as the second group with turnips and Tai-tsai，they all have fleshy roots.Pakchoi 'Huangdu' and Chinese Cabbage ‘Beijing New 3 also belong to the second category. The above results indicate that the genetic composition of the fleshy root type materials in the alfalfa species has certain similarities，but there are also complexities.

Key words：Brassica compestris L.；Fleshy root；Genetic relationship

常見的蕪菁、蘿卜等具有肉質(zhì)根的蔬菜多為耐寒或半耐寒蔬菜[1]。蕓薹種的薹菜在華北地區(qū)能夠露地越冬，研究者認(rèn)為其抗寒性與越冬前形成的肉質(zhì)根有關(guān)[2]。筆者在資源收集中發(fā)現(xiàn)了少見的具有肉質(zhì)根的不結(jié)球類型白菜材料‘14-16，葉片具少量毛刺，葉形似大白菜葉，其能在青島地區(qū)連續(xù)2年露地越冬，并于春天返青。而一般的白菜類蔬菜根系雖然發(fā)達(dá)，但不具肉質(zhì)根，如果沒有保溫設(shè)施，基本無法在山東半島地區(qū)內(nèi)越冬。因此，‘14-16在肉質(zhì)根性狀遺傳和抗凍性育種方面具有重要的研究價(jià)值，但目前仍不清晰其遺傳關(guān)系。蕓薹種分子標(biāo)記的研究開展較早[3，4]，研究結(jié)果均表明，種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，而針對(duì)蕓薹種內(nèi)肉質(zhì)根蔬菜親緣關(guān)系及肉質(zhì)根形成相關(guān)的標(biāo)記的研究報(bào)道目前仍較少。為此，本研究以具有肉質(zhì)根的‘14-16為主要研究對(duì)象，利用分子標(biāo)記手段，通過與具肉質(zhì)根的蕪菁、薹菜及無肉質(zhì)根的普通白菜等蕓薹種蔬菜進(jìn)行種內(nèi)的遺傳比較，分析幾種蔬菜的親緣關(guān)系，特別是‘四季小白菜與其他蕓薹種肉質(zhì)根蔬菜的親緣關(guān)系，為探究蕓薹種肉質(zhì)根蔬菜的親緣關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)選取15分材料，包括不具肉質(zhì)根的3份大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis Olsson）、4份普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee）、2份烏塌菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee），能夠形成肉質(zhì)根的3份薹菜（Brassica campestris L.ssp. Chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort）、2份蕪菁（Brassica campestris L. ssp. rapi fera Matzg）和不結(jié)球的白菜材料‘14-16。材料名稱、來源肉質(zhì)根性狀見表1。

1.2 DNA提取和檢測 15份試驗(yàn)材料于2018年4月6日播種在青島市城陽區(qū)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。5月10日，對(duì)每個(gè)材料選擇3～4個(gè)單株的嫩葉混合取樣，采用CTAB法提取基因組DNA。用0.7%～1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)（美國Thermo NanoDrop 2000）進(jìn)行DNA質(zhì)量、純度和濃度檢測，將基因組DNA濃度稀釋至50ng/μL，-20℃保存。

1.3 引物合成 本試驗(yàn)前期以烏塌菜‘小八葉ב平度薹菜的4個(gè)回交后代自交系及2個(gè)親本為材料對(duì)蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/index.php）中的325對(duì)引物進(jìn)行了鑒定，從中選擇了49對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、可重復(fù)、具有多態(tài)性的引物用于本次試驗(yàn)。引物由青島擎科生物科技有限公司合成，引物位置及序列信息見表2。

1.4 PCR擴(kuò)增及檢測 PCR反應(yīng)總體系為20μL，包含10×PCR Buffer（含25mmol/L MgCl2）2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq 酶0.2μL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL，上下游引物各1.0μL（10μmol/μL），ddH2O 14.4μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離檢測，180V、130mA條件下，電泳100min。用銀染顯色法檢測電泳結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 選擇清晰可辨的電泳條帶，以1和0記錄多態(tài)片段的有和無，在同一位置上出現(xiàn)的電泳條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)的帶記為“0”，以獲得矩陣。采用NTSYSpc（2.1e版）軟件分析供試材料的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析并繪圖[5]。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)對(duì)49對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了聚丙烯凝膠電泳，引物覆蓋6條染色體，15個(gè)材料共獲得99條譜帶，其中89條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為89.89%。每條引物擴(kuò)增出2～6條清晰條帶，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

根據(jù)引物的檢測結(jié)果，通過UPGMA方法聚類分析后得到供試材料的聚類圖（圖2）。群體的遺傳相似性系數(shù)介于0.48～0.83，表明15個(gè)材料間存在較大的遺傳差異。當(dāng)相似系數(shù)在0.62時(shí)，15個(gè)材料分為兩大類。第1類均為無肉質(zhì)根的材料，包括3份普通白菜、2份烏塌菜和2份大白菜。第2類包括有肉質(zhì)根的3份薹菜、2份蕪菁和未知的‘14-16材料，還包括無肉質(zhì)根的大白菜‘北京新3號(hào)、普通白菜‘黃渡矮青菜。在第2大類中，材料‘14-16（9號(hào)）單獨(dú)列為一類，與其他材料在遺傳關(guān)系上有一定距離。在所有15個(gè)材料中，‘14-16與‘金黃蔓菁相似系數(shù)最高，為0.72，與第1大類中的‘新夏青5號(hào)相似系數(shù)最低（0.55），其次為‘金夏蒔（0.56）。以上結(jié)果可以看出，具有肉質(zhì)根性狀的蕓薹種白菜，與無肉質(zhì)根的類型在遺傳關(guān)系上存在一定距離。

3 結(jié)論與討論

本研究利用來源于蕓薹屬數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)記引物分析了未知白菜材料‘14-16與蕓薹種蔬菜中具有肉質(zhì)根和不具有肉質(zhì)根的代表類型之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示，具有肉質(zhì)根的材料在聚類關(guān)系中均歸于一類，與無肉質(zhì)根的蕓薹種類型具有一定的遺傳差異。說明在肉質(zhì)根性狀上來源于白菜基因組的引物能較好地反映蕓薹種群體的遺傳組成。在聚類圖中，“黃渡矮青菜”和“北京新3號(hào)”雖無明顯肉質(zhì)根形成，但仍與肉質(zhì)根類型劃分為同一大類，推測可能與它們的遺傳來源不同有關(guān)。在后期的研究中，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大引物在染色體組上的分布范圍，并增加不同類型測試材料的數(shù)量，以獲得更精確的聚類結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1]羅丹，吳委林，周波，等.蕪菁SSR引物的開發(fā)及多態(tài)性分析[J].生物技術(shù)通訊，2012，23（03）：402-406.

[2]劉倩倩，孫艷，劉維信，等.薹菜肉質(zhì)根發(fā)育過程中糖積累及蔗糖代謝相關(guān)酶活性變化[J].植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（11）：1546-1544.

[3]李光光，黃紅弟，張華，等.利用SSR分子標(biāo)記研究白菜類亞種資源的遺傳多樣性[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2017，38（07）：1316-1322.

[4]劉冬媛，王新華，劉楊，等.不結(jié)球白菜品種（系）遺傳多樣性與親緣關(guān)系的SSR分析[J].分子植物育種，2014，12（03）：499-508.

[5]李桂花，陳漢才，張艷，等.小白菜種質(zhì)遺傳多樣性與親緣關(guān)系的SRAP和SSR分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（05）：37-45.

（責(zé)編：張宏民）