楊解解 陳鑫 薛鵬飛

摘 要：試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法探究不同OD值、侵染時(shí)間及外植體類型對誘導(dǎo)紋黨產(chǎn)生毛狀根的最佳條件，結(jié)果表明，采用OD值0.8A、侵染時(shí)間10min與紋黨幼嫩葉片作為外植體的試驗(yàn)組處理效果最好，毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)55.6%。紋黨幼嫩葉片作為外植體誘導(dǎo)毛狀根處理效果最好，紋黨根、紋黨莖段及無菌苗皆不適宜作為誘導(dǎo)材料。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，誘導(dǎo)出的根基本符合毛狀根的特征，PCR擴(kuò)增得到865bp的DNA目的條帶，證明試驗(yàn)得到的根為發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染誘導(dǎo)得到的毛狀根。

關(guān)鍵詞：黨參；發(fā)根農(nóng)桿菌；毛狀根；組織培養(yǎng)

中圖分類號 Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）07-0026-03

Abstract：In this experiment，the orthogonal test method was used to explore different OD values，infection time and explant type to optimize the hairy roots of the induced striate. The experiment showed that the OD value was 0.8A，the infection time was 10min and the pattern was young. The test group of the tender leaves as the explants had the best treatment effect，and the hairy root induction rate reached 55.6%. The young leaves of the striatum were the best for the treatment of hairy roots as explants，and the stalk roots，the stem segments and the sterile seedlings were not suitable as inducing materials.The 865 bp DNA target band was obtained by morphological observation and PCR amplification. The root obtained in this experiment was confirmed to be the hairy root induced by Agrobacterium rhizogenes R1601 infection.

Key words：Codonopsis pilosula；Agrobacterium rhizogenes；Hairy root；Tissue culture

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.），桔?？泣h參屬，多年生草本植物，為中國常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，含有生物堿、蔗糖、菊糖、葡萄糖、淀粉、粘液質(zhì)及多種微量元素、維生素B1、B2等，特別是硒含量較高，能有效抑制癌癥發(fā)生，增強(qiáng)免疫力[1]，極具開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值[2]。

目前對黨參的研究主要集中在藥理、藥材鑒定、化學(xué)成分分析等方面，關(guān)于離體組織培養(yǎng)的研究較少。隨著基因工程的發(fā)展，已在多種植物上利用發(fā)根農(nóng)桿菌成功誘導(dǎo)了毛狀根，紅豆[3]、喜樹[4]、銀杏[5]、杜仲[6]、烏桕[7]等是木本植物中最具代表性的。紋黨的皂苷、多糖、硒主要存在于根部，而其他部位含量相對較低[8]，毛狀根中含有和原植物中相同或相似、含量相當(dāng)甚至更多、以及分化程度和遺傳穩(wěn)定性高且不易變異的次生代謝產(chǎn)物，還可從毛狀根培養(yǎng)物中尋找新的化合物。建立毛狀根培養(yǎng)體系，可為紋黨皂苷、多糖、硒及其他次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供一條新途徑。

本試驗(yàn)以紋黨無菌苗的葉片、紋黨莖段、紋黨根，紋黨幼嫩葉片作為受體，用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，對紋黨毛狀根誘導(dǎo)條件做初步研究，并進(jìn)行PCR分子鑒定和毛狀根外觀鑒定，為后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)備豐富的材料，奠定紋黨遺傳轉(zhuǎn)化與利用發(fā)根體系生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，為紋黨可持續(xù)開發(fā)利用及其次生代謝物質(zhì)的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，也為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)其他木本植物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 發(fā)根農(nóng)桿菌R1601，文縣紋黨（2016年3月16日于甘肅隴南文縣取樣，苗齡20d），DNA提取試劑盒（天根生化試劑（北京）有限公司）。

1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌活化與懸液制備 將發(fā)根農(nóng)桿菌菌株R1601接種于100mL LB液體培養(yǎng)基（含50mg/L卡那霉素）中震蕩培養(yǎng)26℃活化12h，取1mL菌液于100mL LB液體培養(yǎng)基26℃再活化1次。再用離心管取一定體積的菌液在轉(zhuǎn)速5000rpm，離心10min，棄去上清液，收集菌體，將其轉(zhuǎn)移至1/2MS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度OD值為0.5A、0.8A、1.0A、1.5A、2.0A備用。

1.3 材料預(yù)處理 將幼嫩紋黨苗葉片與帶芽莖段于流水下沖洗15min，無菌條件下0.1%HgCL2中漂洗10min，無菌水漂洗5次。紋黨無菌苗葉片剪成0.5～1.0cm2大小，帶芽莖段剪成0.5～1.0cm，最后用刀片在葉片和帶芽莖段上劃痕。

1.4 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染紋黨 根據(jù)表1的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取不同OD值的菌液侵染預(yù)處理好的外植體，用無菌濾紙吸干菌液，將外植體置于1/2MS培養(yǎng)基中26℃暗培養(yǎng)2～3d，后于含200mg/L羧芐青霉素的1/2MS培養(yǎng)基上做脫菌處理[8]，每3d轉(zhuǎn)移1次，直至不再長菌為止。長出毛狀根后，統(tǒng)計(jì)毛狀根根數(shù)，培養(yǎng)至毛狀根數(shù)量不再有明顯增加時(shí)停止統(tǒng)計(jì)，待毛狀根長至3～5cm時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。另設(shè)一對照組，用無菌水代替菌液。

1.5 毛狀根鑒定 取脫菌完全、生長良好的毛狀根3份與自然條件下生長的紋黨幼嫩葉片，用試劑盒提取總DNA，用作PCR檢測的模板，根據(jù)Slightom等[9]發(fā)表的Ri質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物為：引物1（TTACTGCAGCAGGCTTCATG）和引物（GGCTTTCCCGACCAGAGACT），預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為865bp；PCR反應(yīng)體系為[10]：無菌雙蒸水13μL，10×PCR buffer2.0μL，MgCL2（25mmol/L）1.6μL，taqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，dNTPs（2.5mmol/L）0.2μL，引物1（0.8μmol/L）1μL，引物2（0.8μmol/L）1μL，模板（50ng/μL）DNA2μL；PCR程序?yàn)椋?5℃、2min，40個(gè)循環(huán)（94℃，40s；57℃，30s；72℃，1min），72℃、6min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染色劑染色分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)正交試驗(yàn)可知（表2），采用OD值0.8A、侵染時(shí)間10min與幼嫩葉片的試驗(yàn)組處理效果最好，毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)55.6%（圖1）。以紋黨根和紋黨無菌苗葉片作為外植體不能誘導(dǎo)出毛狀根，可能由于無菌苗葉片過于纖弱，經(jīng)菌液處理和轉(zhuǎn)移到新環(huán)境后細(xì)胞受到損傷，加之不適應(yīng)環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞死亡。紋黨帶芽莖段和紋黨幼嫩葉片皆可誘導(dǎo)出毛狀根，但比較相同侵染條件下，紋黨幼嫩葉片誘導(dǎo)率比莖段高，更適于作誘導(dǎo)材料，但其整體誘導(dǎo)率都不高。

其他條件相同情況下，OD值調(diào)整為0.8A處理效果最好，OD值過低，菌液濃度不夠，侵染成功率低；OD值過高，菌液濃度過高，不利于后續(xù)除菌，材料易染菌死亡。其他條件相同情況下，侵染時(shí)間為10min處理效果最好，侵染時(shí)間過短，質(zhì)粒來不及整合到植物DNA上；侵染時(shí)間過長，植物細(xì)胞易受損死亡。

2.2 分子檢測結(jié)果 試驗(yàn)誘導(dǎo)出的根多分枝、多根毛、無向地性，呈毛發(fā)狀，呈現(xiàn)出毛狀根的基本形態(tài)，且以無菌水代替菌液的實(shí)驗(yàn)沒有得到誘導(dǎo)根。另外隨機(jī)選取3個(gè)幼嫩葉片誘導(dǎo)的毛狀根，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了865bp的目的DNA片段（圖2），且以紋黨葉片DNA為模板的擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增到條帶，表明發(fā)根農(nóng)桿菌R1601的Ri質(zhì)粒中的T-DNA序列含有的rolB基因已經(jīng)整合進(jìn)紋黨的基因組中，證明該試驗(yàn)得到的毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染誘導(dǎo)所致。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用OD值0.8A、侵染時(shí)間10min與幼嫩葉片作為外植體的試驗(yàn)組處理，毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)55.6%。紋黨幼嫩葉片作為外植體誘導(dǎo)毛狀根處理效果最好，紋黨根、紋黨莖段及無菌苗皆不適宜作為誘導(dǎo)材料。一般組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)試驗(yàn)采用的常為無菌苗，但紋黨無菌苗纖細(xì)弱小，組織和細(xì)胞過于脆弱，在進(jìn)行侵染和共培養(yǎng)時(shí)，由于菌液的影響和對新環(huán)境的適應(yīng)性差極易導(dǎo)致死亡，所以不適于作為誘導(dǎo)毛狀根的材料，并且培養(yǎng)適合的無菌苗時(shí)間長，影響試驗(yàn)進(jìn)度。本試驗(yàn)適宜的OD值與侵染時(shí)間與姚慶收等[10]的研究結(jié)果相當(dāng)，都保持在0.5～0.8A、8.0～10.0min。經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)出的根初步具備毛狀根特征，分子檢測結(jié)果進(jìn)一步說明其為毛狀根。本次試驗(yàn)雖誘導(dǎo)出了毛狀根，但毛狀根誘導(dǎo)率低且數(shù)量少，后續(xù)可從其培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間、脫菌方案、菌種選擇等方面加以改進(jìn)，為藥用植物毛狀根誘導(dǎo)及利用毛狀根生產(chǎn)有效藥用物質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：徐世紅）