丁芳芳 張 瑞 呂慧利

連翹，為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)的干燥果實(shí)，連翹首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，言其“味苦、平，主寒熱，鼠瘺瘰癘，癰腫惡瘡，癭瘤，結(jié)熱”。連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功效，現(xiàn)代研究表明，連翹具有抑菌作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、大腸埃希菌、幽門螺桿菌等都具有明顯的抗菌活性[1，2]，以及抗病毒、抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抗癌活性[3]，山西為連翹的主產(chǎn)區(qū)之一，上黨地區(qū)的名醫(yī)們?cè)谂R床實(shí)踐中，積累了諸多應(yīng)用連翹的心得，他們認(rèn)為連翹過(guò)于苦寒，在治療內(nèi)科雜病時(shí)，根據(jù)患者病情，于入藥前將連翹炒制，去性存用，為山西上黨地域的經(jīng)驗(yàn)用藥。本次研究選取連翹中3個(gè)主要有效成分：連翹苷、連翹酯苷、蘆丁為檢測(cè)目標(biāo)，觀測(cè)其炮制前后含量變化，初步探討炒連翹的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器安捷倫1260高效液相色譜儀，DEAAX08007二極管陣列檢測(cè)器，KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器，F(xiàn)LUKE F59紅外測(cè)溫儀。

1.2 藥品與試劑連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17022405)，連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17031610)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17122001),甲醇為色譜純，水為超純水，論文中所涉及的其他試劑均為分析純。連翹為山西連翹，批號(hào)分別為：20170403,20171001,20171006，粉碎過(guò)5號(hào)篩。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 連翹苷的色譜條件色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm；流速0.8 ml·min-1，柱溫為室溫，理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[4]。

2.1.2 連翹酯苷的色譜條件色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85)為流動(dòng)相洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；流速0.6 ml·min-1，柱溫為室溫，理論板數(shù)按連翹酯苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000[4]。

2.1.3 蘆丁的色譜條件色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(45∶55)為流動(dòng)相洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm；流速1 ml·min-1，柱溫為室溫，理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于2000[5]。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 連翹苷對(duì)照品溶液的配制精密稱取連翹苷對(duì)照品6.62 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，既得濃度為327.92 μg·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 連翹酯苷對(duì)照品溶液的配制精密稱取連翹酯苷對(duì)照品2.63 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，既得濃度為130.63 μg·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 蘆丁對(duì)照品溶液的配制精密稱取蘆丁對(duì)照品1.74 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，既得濃度為86.96 μm·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 連翹苷供試品溶液的配制精密稱取0.5 g連翹粉末置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱定重量，浸漬過(guò)夜，超聲處理25 min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，加在中性氧化鋁柱(100～120目，1 g，內(nèi)徑為1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。

2.3.2 連翹酯苷供試品溶液的配制精密稱取0.05 g連翹粉末置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇150 ml，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液既得。

2.3.3 蘆丁供試品溶液的配制精密稱取0.5 g連翹粉末置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液既得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取上述對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋為1、2、3、4、5、6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別含連翹苷、連翹酯苷和蘆丁的梯度濃度。對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μl，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，做線性回歸。連翹苷的回歸方程為:y=5.9769x+7.7299，r= 1.0000，線性范圍為10.25～327.92 μg·ml-1；連翹酯苷的回歸方程為:y=9.4900x+3.9411，r=0.9994，線性范圍為4.08～130.63 μg·ml-1；蘆丁的回歸方程為:y=17.8510x-12.1370，r=0.9999，線性范圍為2.72～86.96 μg·ml-1。見表1。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)品溶液中物質(zhì)濃度 (μg·ml-1)

2.5 精密度試驗(yàn)分別精密吸取連翹苷、連翹酯苷、蘆丁對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示連翹苷、連翹酯苷、蘆丁的峰面積RSD分別為：1.01%、0.44%、0.89%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一連翹藥材(批號(hào)20171001)粉末6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，依2.1法測(cè)得連翹苷、連翹酯苷、蘆丁的峰面積RSD值分別為：1.69%、1.14%、0.71%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液10 μm，按照2.1法分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹苷、連翹酯苷、蘆丁的峰面積RSD值分別為：0.88%，0.70%，0.72%。說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的連翹粉末，加入一定量對(duì)照品，按供試品制備方法制備樣品，測(cè)得連翹苷、連翹酯苷、蘆丁含量，計(jì)算回收率，6次測(cè)得的平均回收率，連翹苷為98.73%，RSD為2.6%；連翹酯苷為99.77%，RSD為1.84%；蘆丁為98.26%，RSD為2.26%。見表2～表4。

表2 連翹苷加樣回收試驗(yàn)

表3 連翹酯苷加樣回收試驗(yàn)

表4 蘆丁加樣回收試驗(yàn)

3 含量測(cè)定

3.1 不同溫度相同時(shí)間炒連翹主要有效成分含量變化取同一批次連翹500 g各5份，用測(cè)溫槍確定炒鍋溫度，分別用110 ℃、130 ℃、150 ℃、170 ℃、190 ℃火力快速翻炒12 min，冷卻，記錄失重，粉碎，過(guò)5號(hào)篩。依前法處理，測(cè)得發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度升高到170 ℃，3種有效成分均開始下降，見圖1。

圖1 不同溫度相同時(shí)間炒連翹有效成分含量變化

3.2 相同溫度不同時(shí)間炒連翹主要有效成分含量變化取同一批次連翹500 g各5份，用測(cè)溫槍確定炒鍋溫度150 ℃，快速翻炒6 min、9 min、12 min、15 min、18 min，冷卻，記錄失重，粉碎，過(guò)5號(hào)篩。依前法處理，測(cè)見隨炒制時(shí)間延長(zhǎng)，連翹苷、蘆丁變化不明顯，連翹酯苷含量自15 min時(shí)快速下降，見圖2。

圖2 不同時(shí)間相同溫度炒連翹有效成分含量變化

據(jù)此確定2因素3水平正交試驗(yàn)的條件，溫度：130 ℃、150 ℃、170 ℃，時(shí)間：9 min、12 min、15 min。

3.3 正交試驗(yàn)取同一批次連翹500 g各9份，如下述條件炒制樣品9份，冷卻，記錄失重，粉碎，過(guò)5號(hào)篩。依前法處理，結(jié)果見表5。

3.4 重復(fù)試驗(yàn)將上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)炮制溫度對(duì)連翹有效成分的影響大于炮制時(shí)間，炒連翹適宜炮制條件為150 ℃，炒制9～12 min，繼續(xù)進(jìn)行3批次重復(fù)驗(yàn)證，選取150 ℃，12 min為炮制條件，按前法處理連翹樣品，結(jié)果見表6。

表6 不同批次生炒連翹有效成分含量對(duì)比

注：t檢驗(yàn)結(jié)果顯示：連翹苷、蘆丁相比P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

炒連翹為山西上黨地區(qū)沿用多年的地方經(jīng)驗(yàn)用藥，屬我院臨方炮制品種，我市名老中醫(yī)張躍英認(rèn)為，生連翹過(guò)于苦寒，久服耗傷人體正氣，炒制連翹去性存用，更適合慢病久病之人，她常用炒連翹治療慢性胃炎、胰腺炎、膽囊炎等病，證見濕重于熱者，且中病即止，不可久服。

本試驗(yàn)旨在觀察連翹炮制前后連翹苷、連翹酯苷、蘆丁的含量變化，為炒連翹提供試驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炒制連翹，提升了連翹苷的含量，降低了蘆丁的含量，而連翹酯苷含量變化不明顯，這可能是因?yàn)槌粗铺岣吡诉B翹苷的溶出率，而蘆丁屬于受熱不穩(wěn)定成分，隨溫度升高，含量逐漸降低。

炒制溫度與炒制時(shí)間相比，炒制溫度對(duì)連翹的有效成分含量影響更大，隨著炒制溫度升高，3種有效成分含量均迅速下降，說(shuō)明炒制連翹需控制好溫度。我們既往經(jīng)驗(yàn)是中火炒制到連翹充分爆殼，這與試驗(yàn)觀察基本吻合：150 ℃火力，翻炒9～12 min至連翹充分爆殼開裂為度。

中藥有效成分非常復(fù)雜，以上試驗(yàn)，僅為炒連翹物質(zhì)基礎(chǔ)的一個(gè)初探，今后，我們還會(huì)從其他試驗(yàn)角度，繼續(xù)對(duì)比生、炒連翹的物質(zhì)變化，以期逐步揭示炒連翹的物質(zhì)基礎(chǔ)。