周婷婷，張景洲

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春130021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)是一種人畜共患的病原菌，主要引起敗血癥、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎及腸炎等細菌感染性疾病[1,2]。SA對環(huán)境的適應(yīng)性較強，對臨床應(yīng)用的抗生素易產(chǎn)生耐藥性[3]。在臨床中可供選擇的藥物種類不多，通過基因水平分析其耐藥性，尋找抗菌靶點將成為治療SA引起特異性感染的一條重要途徑。轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A，SrtA)是金黃色葡萄球菌管家基因，在金黃色葡萄球菌致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。SrtA是一種重要的毒力因子，在細菌的粘附、定殖、入侵、信號傳遞以及逃避機體固有免疫等過程中具有重要作用[5-7]。SrtA可以作為一個新型的潛在抗菌靶點來進行研究。本實驗對SrtA Δ N59基因進行了克隆，開展生物信息學(xué)分析，構(gòu)建重組原核表達載體，為該基因的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

金黃色葡萄球菌ATCC25904、大腸桿菌E.coliJM109、E.coliBL21、原核表達載體pGEX-6p-1均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

pMD18-T 載體、T4 DNA連接酶均購自Promega公司；XhoⅠ、BamHⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker等均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上登錄的Sortase A基因序列(AF162687)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了一對特異性引物。上下游引物5＇端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(下劃線部分)。上游引物為5′-ACGGATCCCAAGCTAAACCTCAAATTCC-3′，下游引物為5′-CCGCTCGAGTTATTTGACTTCTGTAGCTACAA-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成，擴增目的基因片段460 bp。

1.4 SrtA Δ N59基因的克隆

將金黃色葡萄球菌ATCC25904凍存菌劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于3 ml BHI液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。重新挑取菌液接種于5 ml新鮮BHI液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按照試劑盒方法提取基因組DNA。

PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化PCR產(chǎn)物，回收后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109。采用試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)公司進行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)在線軟件TMHMM2.0，DNAMAN軟件對克隆得到的SrtA Δ N59基因核苷酸序列、蛋白結(jié)構(gòu)進行分析。

1.6 重組表達載體的構(gòu)建

提取陽性克隆和表達載體pGEX-6p-1質(zhì)粒DNA，分別用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，將得到的目的基因與載體進行連接，轉(zhuǎn)化進入E.coliBL21感受態(tài)細胞內(nèi)。提取重組菌質(zhì)粒DNA，進行PCR和酶切鑒定。將鑒定為陽性的菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 SrtA Δ N59基因的克隆

經(jīng)PCR擴增后獲得大小約為460 bp目的片段，與預(yù)期結(jié)果相一致(見圖1)。將目的基因克隆到pMD18-T載體上，將陽性菌液進行測序。結(jié)果顯示，與GenBank收錄的SrtA Δ N59基因(AF162687)同源性為99.8%。

2.2 生物信息學(xué)分析

克隆的SrtA Δ N59基因經(jīng)DNAMAM軟件分析，編碼154個氨基酸，分子量大小為20 ku。應(yīng)用TMHMM Server2.0軟件在線預(yù)測顯示，該蛋白在膜外的可能性接近于1(見圖2)，推測該蛋白為膜外蛋白，可在大腸桿菌中表達。

M： DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR擴增產(chǎn)物；2：陰性對照

利用DNAMAN軟件預(yù)測SrtA Δ N59基因編碼蛋白抗原決定簇和疏水性。結(jié)果表明，該基因編碼蛋白具有很強的抗原性(圖3)和親水性(圖4)。

圖2 SrtA Δ N59蛋白的跨膜區(qū)分析

圖3 SrtA Δ N59潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇預(yù)測

圖4 SrtA Δ N59疏水性預(yù)測

2.3 重組表達質(zhì)粒的鑒定

篩選為陽性的重組pGEX-6p- SrtA Δ N59質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定和酶切鑒定。經(jīng)PCR擴增后，獲得一條約為460 bp的目的片段，與預(yù)期的大小相符(見圖5)；用BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒進行酶切后，獲得約為2 600 bp和460 bp的2條目的片段(見圖6)，表明目的基因片段成功插入到原核表達載體中。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組質(zhì)粒pGEX-6p- SrtA Δ N59的PCR產(chǎn)物；2：陰性對照

圖5 重組質(zhì)粒pGEX-6p- SrtA Δ N59的PCR鑒定

M1： DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組質(zhì)粒pGEX-6p- SrtA Δ N59的酶切產(chǎn)物；M2： DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

圖6 重組質(zhì)粒pGEX-6p- SrtA Δ N59的酶切鑒定

3 討論

研究顯示，金黃色葡萄球菌已成為醫(yī)院獲得性感染的主要病原菌之一，且耐藥性問題日益嚴重，給臨床治療帶來了很大麻煩[8]。革蘭氏陽性菌的SrtA 在病原菌致病過程中是重要的靶酶[9]。本試驗對金黃色葡萄球菌SrtA Δ N59基因進行了克隆及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌ATCC25904株SrtA Δ N59與Genbank中SrtA 基因序列(AF162687)核苷酸同源性為99.8%。Srt A蛋白為膜外蛋白，可在大腸桿菌中表達，具有很強的抗原性和親水性。

本試驗去掉了Srt A的信號肽序列，使該基因序列編碼的表面蛋白具有很好的親水性，從蛋白抗原決定簇預(yù)測的結(jié)果可以看出，SrtA基因編碼的表面蛋白仍然保持很強的抗原性，為下一步試驗奠定了基礎(chǔ)。pGEX-6p-1載體是一種常見的原核表達載體，其多克隆位點區(qū)域有多個常用內(nèi)切酶的位點序列，便于基因克隆，且序列中含有tac啟動子、GST標(biāo)簽，是一種高效表達載體，本試驗成功構(gòu)建了pGEX-6p- SrtA Δ N59重組質(zhì)粒，為進一步深入研究SrtA基因奠定了基礎(chǔ)。