李 濤，宛迎春，周長(zhǎng)玉*，蘇子源

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

全球平均每年有100萬(wàn)人被診斷出患有結(jié)直腸癌[12]，結(jié)直腸癌存在的類型多樣，約40%的病例攜帶KRAS突變，10%為BRAF突變[3]。與野生型KRAS患者相比，突變的KRAS預(yù)示著不良的預(yù)后和生存，同時(shí)耐受抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)治療[4-6]。成熟的microRNAs (miRNAs)是內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)RNA分子，長(zhǎng)度僅有18-25 bp，與目標(biāo)mRNA 3’UTR相結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)其翻譯[7]。miRNAs已被廣泛證實(shí)可以調(diào)控基礎(chǔ)細(xì)胞過(guò)程，如增殖，分化，發(fā)育，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期[8]。本課題擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)明確自體吞噬在miR-155誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞死亡和凋亡中的作用，為臨床治療結(jié)腸癌提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人結(jié)腸癌HCT116，SW480，HT-29細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)買于美國(guó)GIBCO公司，1640培養(yǎng)液和細(xì)胞消化用胰酶購(gòu)買于美國(guó)Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和對(duì)照購(gòu)買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，自噬抑制劑3-MA購(gòu)買自美國(guó)Sigma公司，LC3和Cleaved caspase-3抗體購(gòu)買自美國(guó)CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol試劑方法提取細(xì)胞中總RNA，提取總RNA后利用TaqMan進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)，miR-155所用引物和內(nèi)源性對(duì)照U6購(gòu)買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，利用ABI 7300檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用lipofectamine3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)至80%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成Opti-MEM培養(yǎng)液，利用Opti-MEM稀釋lip3000和DNA，同時(shí)在DNA溶解液中加入P3000，室溫孵育10分鐘，滴入已經(jīng)換成Opti-MEM的平皿中，轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，換成正常細(xì)胞培養(yǎng)液，24小時(shí)后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞存活率

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，計(jì)數(shù)，鋪96孔板，按照每孔5000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，鋪板后過(guò)夜等待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行不同分組作用。按照不同的分組作用細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)完成相應(yīng)的作用，待作用時(shí)間完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，輕輕混勻，放入浮箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)后停止作用，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)

蛋白是細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的大分子物質(zhì)，檢測(cè)蛋白水平的改變可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)一些現(xiàn)象的發(fā)生，細(xì)胞蛋白提取和表達(dá)檢測(cè)步驟如下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照分組進(jìn)行分皿，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行相應(yīng)的處理，處理完成后進(jìn)行蛋白的提取，棄除細(xì)胞正常培養(yǎng)液，冷卻的PBS洗細(xì)胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA細(xì)胞裂解液，均勻鋪開后，放置冰上作用5分鐘后，利用細(xì)胞刮將細(xì)胞完全刮除后轉(zhuǎn)至EP管中，放入4℃冰箱搖勻作用30分鐘，3 000 rpm/min離心20 min，取上清后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量(BCA方法)。根據(jù)蛋白濃度絕對(duì)上樣體積，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其變性后，進(jìn)行蛋白質(zhì)丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，將膠上的蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)模轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉2小時(shí)，根據(jù)檢測(cè)蛋白的不同加入相應(yīng)的一抗，低溫孵育過(guò)夜，第二天PBST清膜3次后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2小時(shí)后， PBST清膜3次， ECL發(fā)光顯示，對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同分組下結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)凋亡率的改變。具體步驟如下，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照分組進(jìn)行分皿，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行相應(yīng)的處理，藥物作用完成后，消化收集細(xì)胞，利用冷PBS清洗細(xì)胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用半個(gè)小時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)的方法，三組及三組以上采用方差分析的方法，P<0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞miR-155表達(dá)水平

為明確miR-155在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)和結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480，HCT-116，HT-29)中表達(dá)的差異，我們首先利用了RT-qPCR的方法檢測(cè)了細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞相比，不同種類的結(jié)腸癌細(xì)胞都呈現(xiàn)出了miR-155表達(dá)水平的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響

在檢測(cè)到miR-155表達(dá)水平上調(diào)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討抑制miR-155對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們首先檢測(cè)了SW480細(xì)胞存活率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑可以明顯的降低SW480細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1 RT-qPCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中miR-155表達(dá)水平

*與NCM-460相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

表2 miR-155 inhibitor對(duì)SW480細(xì)胞存活率的影響

*與Control組比較，P<0.05

2.3 miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

在檢測(cè)miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活率影響的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步檢測(cè)了其對(duì)凋亡率的影響，我們首先利用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)了給予miR-155 inhibitor對(duì)凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，miR-155 inhibitor可以明顯的增加結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3。為明確細(xì)胞中凋亡的改變，我們利用Western Blotting的方法進(jìn)一步檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)，結(jié)果見圖1。

表3 miR-155 inhibitor對(duì)SW480細(xì)胞凋亡率的影響

*與Control組比較，P<0.05

圖1 miR-155 inhibitor對(duì)SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 miR-155 inhibitor對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的影響

研究顯示，自噬在mircroRNA與腫瘤之間的關(guān)系中發(fā)揮著重要的作用，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白的改變。Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)，結(jié)果見圖2。

圖2 miR-155 inhibitor對(duì)SW480細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 抑制自噬對(duì)miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細(xì)胞死亡的影響

為明確自噬在miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細(xì)胞死亡中的作用，我們給予細(xì)胞自噬抑制劑3-MA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以進(jìn)一步增加miR-155 inhibitor引起的細(xì)胞存活率的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表4。

表4 抑制自噬對(duì)miR-155 inhibitor引起的 結(jié)腸癌細(xì)胞死亡的影響

*與Control組比較，P<0.05；#與miR-155 inhibitor組，P<0.05

2.6 抑制自噬對(duì)miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

我們進(jìn)一步檢測(cè)了抑制自噬對(duì)miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響，Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以進(jìn)一步增加miR-155 inhibitor引起的cleaved caspase-3表達(dá)的增加，結(jié)果見圖3。

圖3 抑制自噬對(duì)miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家都非常常見的一種惡性消化系統(tǒng)腫瘤[9]。由于對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制和分子調(diào)控認(rèn)識(shí)的局限性，導(dǎo)致了目前治療效果的不佳[10]。因此，如何深入的了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，明確其分子調(diào)控機(jī)制，尋找新的有效的分子治療的靶點(diǎn)成為結(jié)腸癌研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明小分子RNA(miRNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，其通過(guò)靶向調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因的表達(dá)，參與腫瘤的調(diào)控[11]。研究顯示，miR-155在多種癌癥中都呈現(xiàn)出了高表達(dá)，其促進(jìn)了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；同時(shí)，在腫瘤的診斷和預(yù)后中也發(fā)揮了重要的作用[12]。但是，miR-155與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系報(bào)道較少，其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控還不是很清楚。

我們首先檢測(cè)了正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)腸癌細(xì)胞中都呈現(xiàn)出了明顯的miR-155表達(dá)水平的升高。我們進(jìn)一步檢測(cè)了其對(duì)細(xì)胞存活和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155可以引起結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的下降和凋亡率的上升。提示出，miR-155參與了結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。

自體吞噬是細(xì)胞內(nèi)普遍的過(guò)程，通過(guò)自噬體和溶酶體的融合清除不必要的細(xì)胞內(nèi)氨基酸、脂肪酸和核苷酸。多種不利的條件都可以導(dǎo)致自噬的發(fā)生，包括營(yíng)養(yǎng)缺乏，缺氧，DNA損傷，或活性氧(ROS)的產(chǎn)生，通過(guò)自噬過(guò)程，降解不需要的細(xì)胞器以及蛋白質(zhì)，脂肪酸等物質(zhì)，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生存[13]。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著雙重作用。在腫瘤發(fā)生的早期階段，它具有很強(qiáng)的抑制腫瘤發(fā)生的作用。通過(guò)抑制組織損傷，炎癥和基因組不穩(wěn)定來(lái)防止腫瘤的發(fā)生[14]。相比之下,一旦腫瘤在生長(zhǎng)，自噬促進(jìn)其生長(zhǎng)、代謝，因?yàn)樗茏尠┘?xì)胞克服細(xì)胞內(nèi)和環(huán)境壓力[15]。

為明確miR-155對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的影響以及自噬在miR-155 inhibitor引起細(xì)胞毒性中的作用，我們展開了進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155 inhibitor可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，抑制自噬可以明顯的增加miR-155 inhibitor引起的細(xì)胞存活率的下降和凋亡的升高，提示自噬在miR-155 inhibitor誘導(dǎo)細(xì)胞毒性中起保護(hù)作用。

綜上所述，miR-155在結(jié)腸癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制miR-155可以引起結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的下降和凋亡的升高，聯(lián)合自噬抑制劑可以進(jìn)一步增加細(xì)胞毒性。本課題為臨床治療結(jié)腸癌提供了新的靶點(diǎn)和聯(lián)合用藥策略。