套格蘇,王 舉,胡 琦，姜洪偉*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 胃腸外科)

DCC基因是由Fearon等[1]研究結(jié)直腸腫瘤時(shí)用定位克隆的方法確定并命名的一個(gè)腫瘤抑制基因，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子有明顯的同源性。研究發(fā)現(xiàn)DCC轉(zhuǎn)錄物在結(jié)直腸腫瘤組織中顯著降低，在增殖性息肉上皮細(xì)胞中DCC蛋白表達(dá)十分明顯，而在被認(rèn)為是結(jié)直腸癌前體的具有明顯不典型增生的晚期腺瘤中卻未見明顯DCC表達(dá)[2]。還有學(xué)者認(rèn)為DCC基因失活可能是影響大腸癌預(yù)后的重要因素之一，肝轉(zhuǎn)移者發(fā)生DCC表達(dá)失活的主要機(jī)制是發(fā)生了基因突變[3]。本研究通過獲取基因片段，將目的基因插入到表達(dá)載體，并將人結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞懸液注射到裸鼠皮下，使裸鼠成瘤后進(jìn)行相關(guān)的干預(yù)，再對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測量，最后進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C雄性裸鼠15只購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物品系為無特定病原體BALB/C裸鼠，雄性，6-8周。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)管、PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

①通過基因合成方法獲得帶有DCC功能區(qū)的亞克隆質(zhì)粒，通過金唯智基因合成獲得目的片段。將目的基因插入到表達(dá)載體,即將提取的質(zhì)粒pUC57-DCC與載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統(tǒng)進(jìn)行酶切鏈接。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒。酶切鑒定并大量提取質(zhì)粒，將提取的兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。②人結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液，37℃5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對已經(jīng)長滿的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗一次，加入胰酶消化液，37 ℃孵育，待細(xì)胞完全脫落，加完全培養(yǎng)基中和胰酶，離心6 min(1 000 r/min，離心半徑為10 cm)，棄上清。無血清培養(yǎng)基洗2次，加5 ml無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)。用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至1×107個(gè)/ml。③將裸鼠在無特定病原體動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。第7天將SW1116細(xì)胞懸液注射到裸鼠皮下，每只小鼠注射0.2 ml。④建模第15天，觀察裸鼠成瘤情況，測量腫瘤大小。將裸鼠隨機(jī)分為3組(15只體重、年齡相等雄性裸鼠)，對裸鼠進(jìn)行如下干預(yù)實(shí)驗(yàn)：第1組：生理鹽水組(n=5，腹腔注射生理鹽水)；第2組：DCC干預(yù)治療組(n=5，瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射DCC質(zhì)粒，注射50 μg，質(zhì)粒濃度908 ng/μl)；第3組：5-氟尿嘧啶(5-FU)治療組(20 mg/kg體重，腹腔注射，連續(xù)15 d)。⑤經(jīng)上述干預(yù)處理后，每周用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長與寬，稱量裸鼠體重，計(jì)算抑制瘤率；造模第30天處死裸鼠[由于給藥后第15天瘤體無明顯差異，因此多飼養(yǎng)了1周，即給藥后第22天(造模后第30天)取樣檢測]，剝離腫瘤，稱重，拍照，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.3 檢測相關(guān)指標(biāo)

1.3.1細(xì)胞凋亡檢測 取1-2 mm大小的腫瘤組織，然后加入5-10倍體積的胰酶，37 ℃消化7 min，用5 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，過濾得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液離心6 min(1 000轉(zhuǎn)r/min，離心半徑為10 cm)，得到腫瘤單細(xì)胞。后將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液洗1次后，重懸于1×結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)中(將10×Binding Buffer用蒸餾水稀釋)。其中對照用400 μl 1×Binding Buffer，其他處理組用100 μl 1×Binding Buffer。每管加5 μl 磷脂結(jié)合蛋白(FITC-Annexin V)和5 μl碘化丙啶(50 μg/ml)。輕柔彈起混勻，室溫(25 ℃)避光孵育15 min。加400 μl 1×Binding Buffer至每管中，混勻。1 h內(nèi)上流式分析軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.2Western blotting檢測 ①蛋白樣品的處理與定量：用BCA法檢測細(xì)胞裂解液的蛋白濃度，測好濃度的蛋白分裝放于-80℃保存。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.3.3淋巴管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 參照Weidner法進(jìn)行淋巴管計(jì)數(shù)，在低倍顯微鏡(×100)下觀察全切片淋巴管分布情況后，選擇淋巴管密集的3個(gè)區(qū)域，以高倍顯微鏡(×200)計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的淋巴管數(shù)量，以3個(gè)區(qū)域平均值為該標(biāo)本的淋巴管密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 目的基因插入到表達(dá)載體

將提取的質(zhì)粒pUC57-DCC和載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統(tǒng)進(jìn)行酶切。雙酶切鑒定可觀察到在300 bp處有特異性條帶。雙酶切和質(zhì)粒測序結(jié)果表明pCDNA3.1-DCC中含有序列正確的DCC基因。見圖1、圖2。

2.2 對裸鼠瘤重的影響

生理鹽水組、DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組裸鼠的腫瘤重量分別為(0.353±0.119)g、(0.123±0.015)g、(0.147±0.041)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.903，P=0.016)；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組裸鼠腫瘤重量均有所減輕，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但DCC干預(yù)治療組與5-FU治療組相比，瘤重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3組不同干預(yù)措施對裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響，經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3組裸鼠的腫瘤細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.362，P=0.000)。與生理鹽水組相比，DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組總凋亡率均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4 轉(zhuǎn)染后DCC蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后，Western blotting檢測可以發(fā)現(xiàn)，曝光900秒掃膜未檢測到條帶，已重復(fù)3次，均未檢測到DCC蛋白，見圖3?？赡芘cDCC蛋白的表達(dá)量特別低，信號(hào)較弱有關(guān)。

表1 3組不同干預(yù)措施對腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響(%)

注：5-FU為5-氟尿嘧啶；a為與生理鹽水組比較，P<0.05

注：1為Marker；2、3為pUC57-DCC；4、5 注：1為Marker；2、3為pCDNA3.1-DCC為pCDNA3.1 注：1、2為生理鹽水組；3、4為DCC干預(yù)治療組；5、6為5-FU治療組；5-FU為5-氟尿嘧啶

圖1 pUC57-DCC和pCDNA3.1(+)圖2 質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖 圖3 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后DCC蛋白的表達(dá)酶切電泳圖

生理鹽水組、DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達(dá)分別為1.556±0.088、2.061±0.075和2.052±0.114，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.427，P=0.001)。與生理鹽水組相比，DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達(dá)量均增加(均P<0.001)。

2.5 淋巴管計(jì)數(shù)結(jié)果

生理鹽水組、DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組的淋巴管計(jì)數(shù)情況分別是(14.67±0.626)個(gè)、(8.43±1.002)個(gè)、(7.49±0.514)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.489，P=0.039)。與生理鹽水組相比，DCC干預(yù)治療組、5-FU治療組裸鼠的淋巴管數(shù)量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 討論

DCC基因位于人體染色體18q21.3，含有1.4 Mbp和29個(gè)外顯子。其表達(dá)蛋白是I型跨膜蛋白，由1 447個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為190 000。DCC蛋白參與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，使細(xì)胞維持正常的生長和分化方式。當(dāng)DCC基因發(fā)生缺失和突變后，DCC蛋白生成障礙，細(xì)胞的生長和分化紊亂促使細(xì)胞朝著惡性方向演變。DCC基因在絕大多數(shù)正常組織中均有表達(dá)，但在大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)卻有下調(diào)趨勢。DCC基因抑癌的機(jī)制與其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。作為依賴性受體，當(dāng)配體Netrin-1存在時(shí)，DCC與其結(jié)合對細(xì)胞凋亡起到抑制作用，但當(dāng)細(xì)胞缺乏Netrin-1配體時(shí)，DCC則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

DCC基因的胞內(nèi)功能域(3 727-3 792 bp)具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用[4]。DCC基因改變是癌變發(fā)生過程中的早期基因事件，其缺失或失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)促發(fā)因素。DCC蛋白的表達(dá)缺失與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞分化相關(guān)[5]。研究者發(fā)現(xiàn)大腸癌中DCC表達(dá)缺失頻率較高，可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)阻止細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)大腸癌的發(fā)生[6]。

Itoh等[7]研究了人結(jié)直腸癌中DCC mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示與非癌組織相比，30例結(jié)直腸癌中的17例存在DCC mRNA低表達(dá)，且結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的4個(gè)標(biāo)本均表現(xiàn)為DCC mRNA的表達(dá)水平下降，該研究結(jié)果表明，DCC的功能性喪失，有可能是癌癥轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。

DCC基因的表達(dá)缺失可作為判斷大腸癌轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)[8]。大腸癌組織中確實(shí)存在DCC蛋白表達(dá)缺失，且與大腸癌患者Dukes分期有關(guān)；大腸癌組織中存在高頻率DCC基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生，且與直腸癌的關(guān)系更為密切；DCC基因啟動(dòng)子甲基化可能是大腸癌中DCC失表達(dá)的主要機(jī)制之一。轉(zhuǎn)染的DCC基因可以抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致癌胚抗原在SW1116細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，從而降低其浸潤和轉(zhuǎn)移能力[9]。

腫瘤抑制基因的存在主要是由3個(gè)方面提出的：一是通過與正常細(xì)胞雜交抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表型；二是多種腫瘤的染色體缺失；三是腫瘤細(xì)胞特異染色體區(qū)域雜合性缺失。許多研究結(jié)果支持多種腫瘤抑制基因的劑量丟失或改變在廣泛的癌癥發(fā)生和(或)進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[10]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DCC表達(dá)較高，是軸突導(dǎo)向和神經(jīng)元遷移的關(guān)鍵因子。最近，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，Netrin-1和DCC是體細(xì)胞重編程的調(diào)節(jié)器[11]。

DCC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的喪失也與結(jié)直腸腫瘤的數(shù)量和侵襲性有關(guān)，在誘發(fā)抑癌基因突變的背景下，導(dǎo)致高度浸潤性腺癌的發(fā)展。這些研究表明，DCC作為一個(gè)腫瘤抑制劑可通過其能力觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。

本研究采用PCDNA3.1(+)-DCC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染15例皮下結(jié)直腸腫瘤裸鼠后，檢測了DCC蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明DCC蛋白表達(dá)量降低，在3次Western blotting檢測中均未發(fā)現(xiàn)條帶(DCC蛋白)，說明在結(jié)直腸癌中DCC基因失表達(dá)。此外，癌組織中測得淋巴管的數(shù)量也顯著減少。更有說服力的指標(biāo)是DCC干預(yù)治療組裸鼠的瘤重明顯小于生理鹽水組。研究結(jié)果還顯示，與生理鹽水組比較，DCC組總凋亡率有升高，說明DCC基因可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制裸鼠皮下結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的生長和增殖。

綜上，DCC基因能夠抑制結(jié)直腸腫瘤的生長和淋巴管的生成，且抑癌機(jī)制與其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。目前對DCC基因的研究有了很大的進(jìn)步，但是關(guān)于DCC基因的失活機(jī)制、DCC基因與其他基因是如何協(xié)同作用于結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，如何誘導(dǎo)細(xì)胞分化等有待進(jìn)一步研究。