方圓圓,吳 亞,陳彥輝,王建青,楊琍琦

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒科,安徽 合肥230000)

腸道菌群失調(diào)與肥胖和代謝紊亂密不可分[1-3]，腸道菌群通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝和免疫等途徑與大腦進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，能夠影響宿主對(duì)食物的攝取[4]。益生菌以乳酸桿菌和雙歧桿菌為代表[5]，益生菌治療的出現(xiàn)有望糾正由肥胖導(dǎo)致的宿主相關(guān)代謝紊亂[6]。盡管益生菌對(duì)人體有益的分子機(jī)制尚不明確，但部分腸道菌群確可改善肥胖及其引起的相關(guān)代謝性疾病，這有可能與益生菌改善了腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌的分布從而增強(qiáng)上皮屏障功能，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)有關(guān)[7，8]。但目前有相關(guān)研究表明，并不是所有的益生菌均可有效降低體重，改善機(jī)體代謝紊亂的情況，甚至部分益生菌還有可能增加體重和脂肪含量[9-11]。本研究旨在探討兒科臨床上常用的兩種益生菌在不同的劑量下對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的離乳期至性成熟前期肥胖小鼠的體重、相關(guān)脂代謝指標(biāo)及脂多糖含量的影響，并動(dòng)態(tài)檢測(cè)同組小鼠相關(guān)指標(biāo)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)108只3周齡雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠，體重11-13 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。標(biāo)準(zhǔn)飼料及高脂飼料均由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：正常飲食對(duì)照組(NFD組，n=18)，高脂飲食組(HFD組，n=18)，高脂飲食+低劑量嬰兒雙歧桿菌干預(yù)組(HFD+LB組，n=18，含菌量為1×108CFU/ml)，高脂飲食+高劑量嬰兒雙歧桿菌干預(yù)組(HFD+HB組，n=18，含菌量為1×109CFU/ml)，高脂飲食+低劑量酪酸梭菌干預(yù)組(HFD+LC組，n=18，含菌量為1×107CFU/ml)，高脂飲食+高劑量酪酸梭菌干預(yù)組(HFD+HC組，n=18，含菌量為1×108CFU/ml)。各組在原有飲食基礎(chǔ)上，對(duì)照組及高脂飲食組給予生理鹽水灌胃處理，高脂飲食+益生菌干預(yù)組給予不同劑量益生菌混懸液灌胃處理，灌胃體積按照100 μl/10 g小鼠體重計(jì)算。各組均自由飲食，連續(xù)飼養(yǎng)5周，每天灌胃1 次。灌胃期間，每1 d稱量小鼠體重1 次，根據(jù)體重變化及時(shí)調(diào)整灌胃量。所有小鼠實(shí)驗(yàn)期間自由攝食及飲水，控制環(huán)境溫度(22±2℃)和濕度(55%±10%)，明暗周期12 h。

1.2 菌種及實(shí)驗(yàn)室制劑本研究菌種由山東科興生物科技公司提供，嬰兒雙歧桿菌菌粉含菌量為1×1011CFU/g，酪酸梭菌菌粉含菌量為1×109CFU/g，使用無(wú)菌生理鹽水配制成嬰兒雙歧桿菌含菌量為1×108CFU/ml、1×109CFU/ml，酪酸梭菌含菌量為1×107CFU/ml、1×108CFU/ml的混懸液分別進(jìn)行灌胃?？偰懝檀?TC)、 甘油三酯(TG)、 低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。脂多糖(LPS)試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物技術(shù)有限公司。

1.3 血脂相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分別于飼養(yǎng)第一周末，第三周末，第五周末剖殺小鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)剖殺六只，留取血液樣本，采用酶比色法按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行分析，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 脂多糖檢測(cè)分別于飼養(yǎng)第一周末，第三周末，第五周末剖殺小鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)剖殺六只，留取血液樣本，采用酶聯(lián)免疫分析法按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠LPS濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同益生菌對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠體重的影響

由表1可以看出，各組之間在起始體重上并無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組小鼠在最終體重上均低于HFD組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，同時(shí)飼養(yǎng)第一周末，HFD+HC組小鼠體重相較于NFD、HFD、HFD+LC組已出現(xiàn)差異(P<0.05)。第三周末，益生菌干預(yù)各組小鼠與HFD組小鼠體重差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HFD+LB、HFD+LC組在第五周末終體重上明顯高于NFD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HFD+LB、HFD+HB組間小鼠體重于第五周末組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠體重的比較

注:與NFD對(duì)比，aP<0.05，與HFD對(duì)比，bP<0.05，嬰兒雙歧桿菌高低劑量組間對(duì)比，cP<0.05，酪酸梭菌高低劑量組間對(duì)比，dP<0.05。下同。

2.2 不同益生菌對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠血脂成分的影響

與NFD組相比，于飼養(yǎng)第一周末后檢測(cè)HFD組血清中TC、TG 、LDL含量均明顯增高(P<0.05)，HDL含量明顯降低(P<0.05)。益生菌干預(yù)各組與HFD組相比，至飼養(yǎng)第五周末血清中TC、TG 、LDL含量均明顯增高(P<0.05)，HDL含量明顯降低(P<0.05)。同時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠血清中各成分的含量，TC大致呈先增高，后降低，再增高趨勢(shì)，TG、HDL大致呈先增高，后降低趨勢(shì)。見(jiàn)表2-5。

表2 血清TC的比較

表3 血清TG的比較

表4 血清HDL的比較

表5 血清LDL的比較

2.3 不同益生菌對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠脂多糖的影響

與NFD組相比，從飼養(yǎng)第一周末開(kāi)始，HFD組小鼠脂多糖升高明顯 ，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，益生菌干預(yù)各組與HFD組相比，至飼養(yǎng)第五周末血清中LPS含量均明顯降低(P<0.05)。同時(shí)血清中LPS動(dòng)態(tài)變化也大致呈先增高，后降低，再增高趨勢(shì)。見(jiàn)表6。

表6 血清LPS的比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，肥胖以及一些代謝性疾病可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。造成代謝異常的主要原因，是失衡的腸道菌群產(chǎn)生的脂多糖等內(nèi)毒素進(jìn)入人體，被免疫細(xì)胞識(shí)別后產(chǎn)生多種炎癥因子，使得機(jī)體進(jìn)入低度炎癥狀態(tài)，從而產(chǎn)生代謝異常。例如，若長(zhǎng)期進(jìn)食高脂食物，可造成腸道菌群中革蘭陰性菌株的數(shù)量增多，導(dǎo)致腸道內(nèi)脂多糖的大量生成，同時(shí)菌群比例的失調(diào)可引起腸黏膜中緊密連接蛋白ZO-1、occludin變化，從而導(dǎo)致腸道通透性的增加，繼而增加了脂多糖的吸收，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，造成肥胖[12，13]。雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌已被多項(xiàng)研究證實(shí)確能改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物的肥胖指數(shù)、血脂紊亂及胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)[14-17]。同時(shí)亦有研究表明，酪酸梭菌制劑在防治各種腸道疾病和部分腸道外疾病都是有比較顯著的效果，同時(shí)Hua等[18]研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌能刺激Th1 免疫反應(yīng)，有效激活的單核細(xì)胞和DC 從而誘導(dǎo)和維持組織Treg 細(xì)胞，下調(diào)促炎性細(xì)胞因子和上調(diào)抗炎細(xì)胞因子，可改善機(jī)體炎癥狀態(tài)，除此之外，酪酸梭菌的代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的再生和修復(fù)，可有效減少脂多糖的吸收。

本研究中，高脂飲食組與對(duì)照組第三周末體重有差異，從第三周末開(kāi)始，益生菌干預(yù)各組體重明顯低于高脂飲食組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明益生菌能夠改善高脂飲食造成的肥胖。同時(shí)高低劑量益生菌干預(yù)組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，第一周末酪酸梭菌組間即出現(xiàn)差異，第五周末嬰兒雙歧桿菌組間出現(xiàn)差異，表明不同劑量的益生菌對(duì)于改善肥胖的程度不一，本研究中，高劑量益生菌干預(yù)組效果總體優(yōu)于低劑量益生菌干預(yù)組。從血清中各組脂類分析中可以看出，高脂飲食組小鼠較對(duì)照組小鼠，TC、TG 、LDL含量均明顯增高，HDL明顯降低，說(shuō)明高脂飲食能夠?qū)е滦∈笱褐械闹x異常，而益生菌干預(yù)后，各項(xiàng)指標(biāo)有所好轉(zhuǎn)，但仍高于對(duì)照組，說(shuō)明益生菌能夠改善小鼠血液中脂代謝情況，但尚未能完全恢復(fù)正常。對(duì)于高低劑量益生菌干預(yù)組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，嬰兒雙歧桿菌組間TC、LDL最終含量有差異，低劑量嬰兒雙歧桿菌干預(yù)組TC含量低于高劑量嬰兒雙歧桿菌干預(yù)組，而LDL呈現(xiàn)相反結(jié)果。酪酸梭菌干預(yù)組間TC、LDL最終含量無(wú)明顯差異。而TG、HDL含量在益生菌干預(yù)組間均有差異，高劑量益生菌干預(yù)組TG均明顯低于低劑量益生菌干預(yù)組，而嬰兒雙歧桿菌干預(yù)組中低劑量干預(yù)組HDL含量高于高劑量組，酪酸梭菌組間則相反，說(shuō)明不同益生菌雖可改善小鼠脂代謝異常，但益生菌的種類和劑量不同致各項(xiàng)指標(biāo)改善的程度不一。對(duì)比同組小鼠不同階段脂代謝各項(xiàng)指標(biāo)變化可以看出，小鼠各項(xiàng)脂代謝指標(biāo)改變有明顯的趨勢(shì)。從血清中各組LPS含量分析中可以看出，第一周末開(kāi)始，高脂飲食組小鼠血清LPS含量即高于對(duì)照組，而益生菌干預(yù)各組LPS含量均明顯降低，說(shuō)明益生菌干預(yù)后能改善機(jī)體炎癥狀態(tài)，對(duì)比同組小鼠不同階段LPS變化可以看出，小鼠LPS改變亦有明顯的趨勢(shì)，結(jié)合上述結(jié)果，說(shuō)明益生菌干預(yù)小鼠肥胖有最優(yōu)劑量與干預(yù)時(shí)間段。

本研究的創(chuàng)新之處在于選取離乳期小鼠進(jìn)行干預(yù)飼養(yǎng)至性成熟前期，模擬兒童生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，再一次證明益生菌干預(yù)對(duì)于改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖有效果，不同種類益生菌在不同劑量下對(duì)于肥胖個(gè)體改善的效果有差異，并且對(duì)于各項(xiàng)脂代謝指標(biāo)的改善有側(cè)重性，同時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)同組小鼠不同階段相關(guān)脂代謝指標(biāo)及脂多糖的變化，提示在益生菌干預(yù)下相關(guān)指標(biāo)有趨勢(shì)變化。本研究對(duì)于指導(dǎo)臨床應(yīng)用益生菌干預(yù)兒童肥胖起到了很好的借鑒作用，但僅選取了兩種臨床常用益生菌，種類偏少，后期可進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，同時(shí)可進(jìn)一步研究出益生菌干預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)，為臨床用藥療程做指導(dǎo)。