董孟寧， 張建黨，張元峰，韓偉一

(南陽市中心醫(yī)院 神經外科，河南 南陽473009)

膠質瘤是中樞系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有較高的癌細胞轉移率和致死率。據報道，經常規(guī)治療的膠質瘤患者生存時間中位數(shù)僅有15個月[1]。因此探究膠質瘤發(fā)生發(fā)展機制，尋找治療膠質瘤的新方法顯得尤為迫切。長鏈非編碼RNA是一類在哺乳動物體內高度保守的RNA，不參與蛋白質的編碼，但能通過調控基因的表達過程影響疾病的發(fā)生發(fā)展，如影響基因轉錄、翻譯后修飾及調控表觀遺傳等[2]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs在多類疾病中均出現(xiàn)表達異常，特別是癌癥[3,4]。大量研究表明，LncRNAs在膠質瘤中表達也有不同程度的升高和降低，如LncRNA CCAT1在膠質瘤細胞中表達升高，能通過靶向抑制微小型RNA-410(microRNA-410,miR-410) 的表達促進膠質瘤細胞增殖[5]。LncRNA GRNDE在膠質瘤細胞中表達增多，能通過調控mTOR信號通路促進膠質瘤細胞生長和侵襲[6]。也有研究表明，LncRNA HOTAIR在膠質瘤中表達升高，與膠質瘤患者的存活時間及預后密切相關，可作為膠質瘤生物標記物[7,8]。HOTAIR可通過靶向調控miR-326的表達影響膠質瘤細胞的生長[1]。miR-1是一類抑癌基因，在膠質瘤中呈低表達水平，Su DN等人研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能通過負向調控miR-1的表達促進肝癌的發(fā)展[9]，但HOTAIR是否能通過靶向調控miR-1的表達影響膠質瘤細胞的生存及侵襲轉移能力還未見報道。本文通過沉默HOTAIR的表達，探究HOTAIR對膠質瘤細胞生存、侵襲及遷移的影響及機制，為HOTAIR應用于臨床膠質瘤的預防及治療提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人膠質瘤細胞株U87、U251、U118和LN18購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American type culture collection,ATCC)。RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，青霉素和鏈霉素購自美國BI公司。Trizol試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自北京索萊寶生物公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光素酶報告檢測試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司。shRNA HOTAIR (sh-HOTAIR) 和miR-1 inhibitor購自上海吉滿生物科技公司，實驗所用引物采用Primer 3網站設計，由上海生工合成。Ki67、Bcl-2、Bax、基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2,MMP-2) 和MMP-9購自美國Santa Cruz公司，實驗所有二抗購自上海博士德生物科技公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清，100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人膠質瘤細胞株U87、U251、U118和LN18，培養(yǎng)環(huán)境條件為37 ℃、5% CO2，隔天進行換液，細胞融合率達到85%以上時進行傳代，傳代濃度為1×104個/mL。

1.3 細胞分組及轉染

將細胞分為Control組、sh-HOTAIR組、miR-1 inhibitor組和sh-HOTAIR + inhibitor組，將細胞接種于6孔板中，種板濃度為1×105個/mL。培養(yǎng)24 h后，根據轉染試劑盒說明書用sh-HOTAIR轉染sh-HOTAIR組細胞，miR-1 inhibitor轉染miR-1 inhibitor組細胞，用sh-HOTAIR和miR-1 inhibitor同時轉染sh-HOTAIR + inhibitor組細胞，Control組則加入等量載體進行處理。轉染6 h后更換為正常細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，進行后續(xù)檢測。

1.4 RT-PCR檢測HOTAIR和miR-1的表達

用Trizol試劑提取膠質細胞株U87、U251、U118和LN18及用sh-HOTAIR處理后的U251細胞的總RNA進行定量分析后，每組取等量的RNA根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀進行擴增后，采用實時定量PCR試劑盒對其進行定量分析。

1.5 熒光素酶報告實驗

通過生物信息預測HOTAIR和miR-1的結合片段，采用PCR進行擴增并插入到熒光素酶報告酶載體中，構建HOTAIR 野生型 (wt) 質粒；采用基因突變技術對HOTAIR序列上與miR-1的結合位點的個別核苷酸進行突變 ，構建HOTAIR突變型 (mut) 質粒。用miR-1 mimic和HOTAIR wt或HOTAIR mut共同轉染U251細胞，24 h后檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.6 CCK8檢測細胞活性

按照1.3所描述的方法轉染各組細胞，轉染后分別培養(yǎng)0 d、1 d、2 d、3 d和4 d根據CCK8試劑盒說明書每孔分別加入10 μl的CCK8溶液，37 ℃孵育3 h后于450 nm處檢測各組細胞吸光度，計算細胞的增殖生長倍數(shù)。

1.7 流式檢測細胞凋亡

將細胞按照1.3所描述的方法進行處理后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的冷酸鹽緩沖液清洗3次后，用結合緩沖液將細胞密度調整至1×106個/mL，取100 μl細胞懸液加入到試管中，并加入5 μl的Annexin V和10 μl的PI溶液，室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.8 Transwell檢測細胞侵襲能力

實驗前將Matrigel放于4 ℃融化，融化后取少量Matrigel加入到Transwell小室中進行預包被，并盡量避免氣泡產生。將細胞接種于Transwell小室內，按照1.3的方法進行分組后轉染，用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后用棉簽擦去上層未遷移的細胞，用HE染色液將下層遷移細胞染色并進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

實驗前用記號筆于12孔板背面劃線，使至少有5條線穿過每個培養(yǎng)孔。將細胞接種于12孔板中，并進行分組轉染。轉染后用10 μl的槍頭垂直于背面直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液洗去被刮下的細胞，換用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。記錄0 h和24 h的劃痕寬度，計算劃痕閉合率[劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.10 免疫印跡檢測相關蛋白表達

將細胞進行轉染后，用裂解液提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒進行定量分析后，調平各組細胞蛋白濃度。每組分別取30 μg蛋白質用10% SDS-PAGE分離各組蛋白，用半干法將蛋白質轉移到PVDF膜并加入5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，之后加入適應濃度一抗于4 ℃孵育過夜，第二天洗去未結合一抗，加入二抗于37 ℃孵育1 h后，滴加化學發(fā)光顯色液進行曝光顯色。以GAPDH為內參。

1.11 統(tǒng)計學分析

本文所有實驗數(shù)據均用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行分析。先對實驗數(shù)據進行正態(tài)分布和方差齊性分析，符合條件者采用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件則采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 sh-HOTAIR促進miR-1表達

如圖1所示，HOTAIR在多類膠質瘤細胞株中的表達水平以U251細胞最高，因此選擇U251細胞進行后續(xù)實驗。用sh-HOTAIR轉染細胞后發(fā)現(xiàn)，sh-HOTAIR能顯著降低U251細胞HOTAIR的表達水平 (P<0.001，圖2)，并顯著升高miR-1的表達水平 (P<0.001，圖2)，表明HOTAIR能抑制miR-1的表達。

圖1 HOTAIR在膠質瘤細胞株中的表達

圖2 sh-HOTAIR對U251細胞HOTAIR和miR-1

2.2 HOTAIR與miR-1的靶向關系

生物信息預測結果表明，miR-1序列上存在HOTAIR的結合位點。同時，miR-1 mimic能顯著升高U251細胞miR-1的表達水平 (P<0.001，圖3)，并且還能降低HOTAIR野生質粒的熒光素酶活性 (P<0.001，圖3)，將結合位點核苷酸進行突變后，miR-1 mimic對HOTAIR質粒熒光素酶活性的抑制作用消失，提示HOTAIR能靶向結合miR-1。

圖3 HOTAIR與miR-1的靶向關系

2.3 sh-HOTAIR抑制U251細胞增殖

與Control組比較，sh-HOTAIR組細胞生長倍數(shù)明顯降低 (P<0.001，圖4)，miR-1 inhibitor組細胞生長倍數(shù)明顯升高 (P<0.01，圖4)，差異有統(tǒng)計學意義；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細胞生長速度明顯升高(P<0.001，圖4)，差異有統(tǒng)計學意義。同時，sh-HOTAIR組細胞增殖相關蛋白Ki67的表達水平與Control組比較明顯降低 (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor組Ki67表達水平明顯高于Control組 (P<0.001，圖8)；sh-HOTAIR + inhibitor組Ki67表達水平與sh-HOTAIR組比較明顯升高 (P<0.01，圖8)，差異有統(tǒng)計學意義，表明sh-HOTAIR能通過誘導miR-1表達抑制U251細胞增殖。

圖4 sh-HOTAIR對U251細胞增殖的影響

2.4 sh-HOTAIR誘導U251細胞凋亡

如圖5所示，與Control組比較，sh-HOTAIR組細胞凋亡率明顯升高 (P<0.001，圖5)，miR-1 inhibitor組細胞凋亡率明顯降低 (P<0.01，圖5)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細胞凋亡率明顯升高 (P<0.001，圖5)，差異有統(tǒng)計學意義；此外，sh-HOTAIR能顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達 (P<0.001，圖8)，誘導促凋亡因子Bax表達 (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor能顯著升高Bcl-2的表達水平 (P<0.01，圖8)，降低Bax的表達水平(P<0.01，圖8)；miR-1 inhibitor還能顯著減弱sh-HOTAIR對Bcl-2和Bax表達的調控作用 (P<0.01，圖8)，表明sh-HOTAIR能通過促進miR-1表達誘導U251細胞凋亡。

2.5 sh-HOTAIR抑制U251細胞侵襲

與Control組比較，sh-HOTAIR組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.001，圖6)，miR-1 inhibitor組侵襲細胞明顯增多(P<0.01，圖6)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組侵襲細胞明顯增多 (P<0.01，圖6)，表明sh-HOTAIR能通過誘導miR-1表達降低U251細胞侵襲能力。

2.6 sh-HOTAIR抑制U251細胞遷移

與Control組比較，sh-HOTAIR組細胞劃痕閉合率明顯降低 (P<0.001，圖7)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細胞劃痕閉合率顯著升高(P<0.01，圖7)，差異有統(tǒng)計學意義。同時，sh-HOTAIR能顯著抑制U251細胞侵襲和遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達 (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor能顯著促進MMP-2和MMP-9的表達 (P<0.01，圖8)，miR-1 inhibitor還能顯著減弱sh-HOTAIR對MMP-2和MMP-9表達的促進作用 (P<0.01，圖8)，提示sh-HOTAIR能通過抑制miR-1的表達抑制U251細胞遷移。

圖5 sh-HOTAIR對U251細胞凋亡的影響

圖6 sh-HOTAIR對U251細胞侵襲的影響

圖7 sh-HOTAIR對U251細胞遷移的影響

圖8 sh-HOTAIR對Ki67、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9表達的影響

3 討論

目前大量研究表明，LncRNA的異常表達不僅能影響真核細胞基因的表達，同時還能促進疾病的發(fā)生發(fā)展，能通過調控細胞增殖使細胞獲得無限增殖的能力，導致癌癥的發(fā)生，同時還能促進癌癥轉移，誘導癌癥惡化[10,11]。HOTAIR是一類致癌基因，于2010年首次被報道其與乳腺癌患者癌癥的轉移相關[12]。隨后大量研究報道表明HOTAIR在其他各類癌癥中均表現(xiàn)為高表達狀態(tài)，并且與癌癥的發(fā)生有著密切關系[13,14]。也有大量研究表明，HOTAIR在膠質瘤細胞及患者的腫瘤組織中表達均明顯增多，并與膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移有關[15]。但具體作用機制有待進一步探究。本研究首先檢測了HOTAIR在幾類膠質瘤細胞株中的表達情況并發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在U251細胞中表達水平最高，因此選擇U251細胞進行后續(xù)實驗。

miR-1是一類在多種癌癥中低表達的miRNA，在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到負向調控的作用[16]。上調miR-1的表達能通過調控表皮生長因子受體抑制膠質瘤細胞的遷移，從而減緩膠質瘤患者病情的惡化[17]。本文研究結果表明下調HOTAIR的表達能顯著升高miR-1在U251細胞中的表達水平，提示HOTAIR可能抑制miR-1的表達。生物信息預測結果表明，miR-1基因序列上存在連續(xù)的HOTAIR的結合位點。此外，熒光素酶報告實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-1 mimic能顯著減弱HOTAIR熒光素酶的活性，將HOTAIR序列上的個別結合位點突變后miR-1 mimic抑制熒光素酶活性的抑制作用消失，進一步證明HOTAIR能靶向抑制miR-1的表達。

細胞無限增殖是癌癥的主要特征之一，抑制癌細胞增殖也是目前臨床放化療治療癌癥的主要作用機制。研究表明，抑制HOTAIR的表達能抑制多種癌細胞的增殖，作用機制與調控miRNAs的表達有關。LIU SH等人在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能通過靶向抑制miR-331-3p的表達促進人類表皮生長因子受體2表達促進胃癌腫瘤的生長[18]。HOTAIR還能通過靶向抑制miR-1的表達調控食道鱗狀細胞癌細胞周期，從而促進癌細胞增殖[19]。Di W等人研究表明，HOTAIR能通過調控miR-1-CCND信號軸促進甲狀腺癌細胞的生長、抑制癌細胞凋亡[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，用sh-HOTAIR沉默HOTAIR的表達后，U251細胞的增殖速度和增殖相關蛋白Ki67的表達水平明顯降低，細胞凋亡水平明顯升高；用miR-1 inhibitor進一步抑制miR-1表達后細胞增殖速度明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，并且還能顯著減弱sh-HOTAIR對細胞增殖及Ki67表達的調控作用。此外，sh-HOTAIR還能抑制Bcl-2表達，促進Bax表達。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，在多種腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，能通過抑制Bax表達促進細胞存活[21]。結合實驗結果表明sh-HOTAIR能通過上調miR-1的表達抑制U251細胞存活，提示HOTAIR能通過靶向抑制miR-1表達促進膠質瘤U251細胞生長。

癌細胞的侵襲和遷移是癌癥轉移的主要過程，血管周圍侵襲性生長也是膠質瘤細胞增殖的主要方式，因此抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移是治療膠質瘤的關鍵[22]。研究表明，HOTAIR在癌癥中的高表達與癌癥的轉移密切相關，抑制HOTAIR表達有利于減緩癌癥的發(fā)展[23]。研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能促進卵巢癌SKOV3細胞侵襲和遷移[24]，還能通過靶向下調miR-1在肝癌中的表達抑制肝癌細胞的生長、侵襲和遷移[9]。本文實驗結果表明，沉默HOTAIR的表達能抑制U251細胞侵襲和遷移，miR-1 inhibitor能顯著減弱sh-HOTAIR對U251細胞侵襲和遷移的抑制作用，表明sh-HOTAIR抑制膠質瘤U251細胞侵襲和遷移的作用與調控miR-1的表達有關。此外，sh-HOTAIR還能顯著抑制MMP-2和MMP-9的表達，抑制miR-1表達能減弱sh-HOTAIR對MMP-2和MMP-9的調控作用。MMP-2和MMP-9是細胞侵襲和遷移的關鍵蛋白，能通過促進細胞外基質的降解增加癌細胞的運動能力，從而促進癌細胞的轉移[25]。進一步表明HOTAIR能通過靶向抑制miR-1的表達促進膠質瘤U251細胞侵襲和遷移。

綜上所述，sh-HOTAIR能抑制膠質瘤U251細胞增殖及Ki67表達、誘導細胞凋亡及Bax表達并降低Bcl-2的表達水平，miR-1inhibitor能顯著降低sh-HOTAIR對細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的調控作用；同時，sh-HOTAIR還能減少U251細胞侵襲，抑制細胞遷移及MMP-2和MMP-9表達，miR-1inhibitor能顯著減弱sh-HOTAIR對膠質瘤細胞侵襲和遷移的調控作用。提示HOTAIR能通過靶向miR-1促進膠質瘤U251細胞增殖、侵襲和遷移，為HOTAIR應用于臨床膠質瘤的診斷及治療提供了理論依據。