張 健,王金有,劉澤華,范洪武,梁鉑堅(jiān)，呂佳音

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科,吉林 長(zhǎng)春130033)

骨肉瘤為惡性程度較高骨腫瘤,臨床上常見(jiàn),目前發(fā)病年齡具有年輕化的趨勢(shì),10歲-25歲為該疾病的主要發(fā)病年齡段,年發(fā)病率可達(dá)3/100萬(wàn)。早期轉(zhuǎn)移是該疾病的特點(diǎn),約50%的患者在開(kāi)始診治時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。侵襲轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處血行轉(zhuǎn)移為主要的播散方式。最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移臟器為肺部轉(zhuǎn)移,因早期無(wú)明顯的臨床癥狀,出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移后5年生存率在30%以下。因此在早期診斷是提高生存率的重要方式。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA,不同功能miRNA作用于不同的靶向基因,調(diào)控基因的表達(dá)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miRNA發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IL-8是能夠趨化誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的炎性介質(zhì),促進(jìn)炎癥反應(yīng)的過(guò)程。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),其在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[1]。本次研究血清 miR-223在骨肉瘤患者中的表達(dá)及臨床意義,探究血清IL-8與miR-223聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于骨肉瘤早期診斷的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年9月至2018年6月我院及協(xié)作醫(yī)院收治的骨肉瘤患者38例(男12例,女26例,年齡15.45±4.20歲),均行根治性骨肉瘤切除術(shù),收集骨肉瘤組織。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①骨肉瘤的診斷參考《SEOM clinical guidelines for the treatment of osteosarcoma in adults》[2]；②臨床資料準(zhǔn)確且完整,未進(jìn)行放療或者化療。③由2名病理醫(yī)師確定病理診斷。另選取同期健康體檢者38例(男16例,女22例,年齡17.89±4.93歲)進(jìn)行對(duì)照研究,所有參與者簽署知情同意書(shū),同時(shí)排除具有可能影響檢測(cè)結(jié)果合并其他疾病的患者。

1.2 檢測(cè)方法

①實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-223的含量。各稱取50 mg腫瘤組織以及癌旁組織,液氮研磨,提取總RNA(Trizol)；RNA核酸定量?jī)x定量并保存于-80℃的環(huán)境下。采用北京博奧森生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按要求配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。qRT-PCR采用miScrpt SYBR Green PCR kit方法檢測(cè),并按照操作要求配制反應(yīng)體系。miR-2的上游引物序列為5’-CATGGCATCTGTCTGGCTGCC-3’下游引物5’-AACTCTTGCAATTTGGTC-3’；內(nèi)參U6上游引物序列5’-CTCGCTGGCAGACAGAC-3’,下游引物序列5’-AACGCTTGACATGGGAAAT-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。95℃條件下預(yù)變性5 min,95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)變性和延伸后收集。反應(yīng)條件：78℃ 20 s。采用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。②ELISA檢測(cè)血清IL-8的含量?？崭共扇≈獠快o脈血5 ml,離心去上清,按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),試劑盒購(gòu)自上海寶龍生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 血清中miR-223和IL-8在兩組中的表達(dá)

骨肉瘤組的血清miR-223表達(dá)明顯降低,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨肉瘤組的血清IL-8的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示,二者之間呈低度相關(guān)(r=0.318,P<0.05)。

2．2 骨肉瘤組miR-223和IL-8的表達(dá)與相關(guān)因素關(guān)系

分析骨肉瘤患者的臨床因素,結(jié)果顯示,miR-223和IL-8的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類(lèi)型無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而不同轉(zhuǎn)移情況的患者的miR-223和IL-8表達(dá)量組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 骨肉瘤組與對(duì)照組的miR-223與IL-8的 表達(dá)

表2 骨肉瘤組織miR-223和IL-8的表達(dá)與臨床病理的 相關(guān)分析

*P<0.05**P<0.01

2.3 ROC曲線分析特異度和敏感度

圖1所見(jiàn),采用 SPSS 21.0 繪制ROC的曲線圖顯示,miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937,提示二者聯(lián)合檢測(cè)的效能可能高于miR-223和IL-8單一檢測(cè)(P<0.05)。以約登指數(shù)(敏感度+特異度-100%)最大為原則,選擇最佳截?cái)嘀禐樵\斷界值,得到敏感度及特異度，并計(jì)算準(zhǔn)確度。見(jiàn)表3。

圖1 miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤的診斷主要包括X線、CT、MRI等放射手段以及血清的堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶檢測(cè),但由于骨肉瘤早期常無(wú)明顯的癥狀,故在常規(guī)體檢中很難發(fā)現(xiàn)骨肉瘤[3]。往往在出現(xiàn)臨床癥狀或者確診骨肉瘤時(shí),大多患者已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,延誤醫(yī)治。因此,尋找敏感度高、特異度強(qiáng)的檢測(cè)方式具有重要的臨床意義。miRNA 在真核生物中廣泛存在,外周血清中性能穩(wěn)定且耐酶降解、耐酸、耐堿、耐低溫,因此為miRNA成為腫瘤標(biāo)志物用于檢測(cè)提供了必要的前提。研究顯示,miR-223在多種腫瘤中的表達(dá)出現(xiàn)異常[4,5]。在骨肉瘤的研究中,多個(gè)miRNA包括miR-7、miR-10b、miR-181、miR-190、miR-214等被認(rèn)為參與了骨肉瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移[6],miR-223也是其中重要一員[7-10]。本次研究顯示,骨肉瘤組血清miR-223表達(dá)明顯降低,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)進(jìn)一步對(duì)比臨床資料分析,miR-223表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類(lèi)型無(wú)關(guān),而不同轉(zhuǎn)移情況患者的miR-223表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,即miR-223在有腫瘤轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中有更低的表達(dá),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這提示在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-223表達(dá)的下降可能是其關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。此前,Dong等人的研究也得出近似的結(jié)論,他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),miR-223可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,與miR-223高表達(dá)的患者相比,miR-223低表達(dá)患者的存活時(shí)間顯著縮短[11]。這可能意味著miR-223有望成為早期篩查和診斷骨肉瘤以及判斷預(yù)后的新的標(biāo)志物。

表3 血清miR-223和IL-8檢測(cè)骨肉瘤的敏感度和特異度

在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中,炎性介質(zhì)同樣發(fā)揮了重要的作用[12,13]。如IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。魯俊杰等的研究發(fā)現(xiàn),IL-8表達(dá)異常與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14],IL-8的高表達(dá)是骨肉瘤進(jìn)展的重要依據(jù),對(duì)疾病的診斷以及病情的評(píng)估具有重要的價(jià)值[15]。劉濤等研究顯示,IL-8 在循環(huán)腫瘤細(xì)胞自我種植促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,可為骨肉瘤患者早期診斷和治療提供一個(gè)新的策略[16]。本次研究顯示,骨肉瘤組的血清IL-8的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類(lèi)型無(wú)關(guān),而在轉(zhuǎn)移情況上表達(dá)量的組內(nèi)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這與上述報(bào)道一致。因此,IL-8也可作為骨肉瘤診斷的標(biāo)志物之一。

由于考慮到惡性腫瘤的檢測(cè)和診斷過(guò)程中,漏診可能導(dǎo)致的不良后果,我們按照“并聯(lián)”診斷的原則,即任一指標(biāo)為陽(yáng)性者即診斷為陽(yáng)性,以此來(lái)判斷聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果和價(jià)值,并同時(shí)對(duì)比分析了二者單獨(dú)檢測(cè)對(duì)骨肉瘤診斷的結(jié)果和價(jià)值。分析結(jié)果顯示miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937。二者聯(lián)合檢測(cè)較任一單一檢測(cè)在敏感度上有了較大幅度的提升,而特異度僅有較小幅度的下降。這點(diǎn)在疑似骨肉瘤患者的早期篩查及診斷方面,有效地減少了漏診的幾率,對(duì)臨床腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重要的意義,但由于其偏低的特異度,我們認(rèn)為在臨床實(shí)際應(yīng)用中,尚需要結(jié)合其他診斷方式進(jìn)一步排查,避免誤診。由于本次研究的樣本數(shù)量有限,病患來(lái)源相對(duì)集中,miR-223診斷的準(zhǔn)確性、miR-223與IL-8之間的相關(guān)性、聯(lián)合診斷的可靠性以及是否還有其他更具臨床價(jià)值的聯(lián)合檢測(cè)手段等還需更大樣本量進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本次研究表明,骨肉瘤患者血清miR-223表達(dá)下調(diào),與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,有望成為骨肉瘤分子診斷的重要標(biāo)志物。miR-223和IL-8聯(lián)合檢測(cè)具有較高的敏感度,能夠有效減少漏診的幾率,提高臨床中對(duì)骨肉瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷能力,可能成為新的臨床篩查、診斷的有效手段,而且可能成為判斷骨肉瘤患者預(yù)后的一項(xiàng)有效指標(biāo)。