夏平友, 張 全, 肖同梅, 倪賢華, 劉學風, 張新勇

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

冬瓜籽是葫蘆科植物冬瓜干燥成熟的種子[1]，其味甘，性微寒[2]。冬瓜籽營養(yǎng)豐富且有很高的藥用價值，具有清熱化痰等效果[3-4]。冬瓜籽中含有皂苷等物質(zhì)，具有抗氧化等作用[5]，研究顯示皂苷具有抑制血小板聚集，降低血脂等作用[6]，棘孢曲霉菌株可以經(jīng)過誘導產(chǎn)生白頭翁皂苷糖苷酶[7]。半仿生法主要通過模擬胃、小腸、大腸內(nèi)環(huán)境酸度來模仿藥物在機體內(nèi)轉(zhuǎn)運原理提取藥物中活性成分[8]。國內(nèi)關(guān)于半仿生法對冬瓜籽中主要藥效成分的提取工藝研究較少，故本文在半仿生法的基礎上用正交試驗法優(yōu)化冬瓜籽中皂苷提取工藝，為冬瓜籽相關(guān)研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

儀器：HH-6恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；HDM-1000D攪拌電熱套(江蘇省榮華儀器制造有限公司)；UV-1601紫外可見分光光度計(北京分析瑞利儀器有限公司)；LE204E/02電子天平(上海書培實驗有限公司)。試劑：所用試劑均為分析純(天津市致遠化學試劑有限公司)。材料：人參皂苷Rb1(上海源葉生物有限公司，批號：B21051)；冬瓜籽(單邊，安徽亳州)。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照液配制 精密稱定人參皂苷Rb1對照品15.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中。

1.2.2 對照液吸光度測定 向20 mL具塞試管中分別加入對照液0、0.15 mL，75 ℃水浴揮干溶液，分別加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反應15 min，再放入冰水充分冷卻后加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后靜置4 min，以相同溶劑在相同操作下作為空白對照，由掃描結(jié)果可知在551 nm處較好。另取7支20 mL試管分別加入0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL對照液，在551 nm測吸光度,以橫坐標為對照液濃度C,縱坐標為吸光度y繪制標準曲線，并計算R2。

1.2.3 待測液配制 將冬瓜籽粉碎過12目篩，稱定9份冬瓜籽粉，每份精密稱定5.000 0 g。根據(jù)半仿生法模擬人體內(nèi)部消化環(huán)境，人體胃中下部pH值為1.0～2.0，大腸和小腸pH值為4.0～7.0，十二指腸pH值為7.0～8.5，以水作為提取溶劑，分別在不同溫度、時間、液料比下對同一份冬瓜籽粉加熱回流提取3次，總時間比為2∶1∶2，每次過濾后保留濾渣，并用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液依次調(diào)節(jié)pH值為2.0、6.0和7.5，合并3次提取液，濃縮定容到500 mL容量瓶并編號待測液1～9號。

1.2.4 待測液皂苷含量測定 從1～9號容量瓶各吸取待測液1.0 mL并在70 ℃水浴揮干溶劑后用甲醇溶解，經(jīng)過濾后將濾液移至2.0 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，從中移取0.40 mL至20 mL試管中，測定吸光度y，計算求得皂苷含量(mg/g)。

1.2.5 加樣回收試驗 從已知冬瓜籽皂苷含量1～5號待測液中每份吸取1.0 mL，分別加入對照液0.10 mL,在1.2.4節(jié)下按相同方法處理，測定吸光度y并代入標準曲線方程求得皂苷含量(mg/g)，結(jié)果表明該法正確、穩(wěn)定。

1.3 單因素試驗

1.3.1 提取溫度考察 分別稱取5份5.000 0 g冬瓜籽粉于500 mL圓底燒瓶中，液料比為1∶20，提取總時間90 min，在一系列溫度(60、70、80、90、100 ℃)條件下用緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值分別為2.0、6.0、7.5，按1.2.2節(jié)下處理，在1.2.4節(jié)下測定皂苷含量(mg/g)。

1.3.2 提取時間考察 取5個500 mL圓底燒瓶分別加入5份5.000 0 g冬瓜籽粉，在液料比、提取溫度分別為1∶20和90 ℃時，在一系列提取時間(90、120、150、180、210 min)條件下,用PBS緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值為2.0、6.0、7.5，按1.2.2節(jié)下處理，在1.2.4節(jié)下測定皂苷含量(mg/g)。

1.3.3 液料比考察 稱取5份冬瓜籽粉，每份5.000 0 g分別置于500 mL圓底燒瓶中，設定提取溫度為90 ℃，提取總時間為180 min，在一系列液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)條件下用PBS緩沖液調(diào)節(jié)最終pH值為2.0、6.0、7.5，在1.2.4節(jié)下測定皂苷含量(mg/g)。

1.4 正交試驗設計

在其他條件相同情況下，以冬瓜籽皂苷含量為指標考察提取溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)對冬瓜籽皂苷提取率的影響，采用L9(34)正交表進行試驗設計(表1)。

表1 冬瓜籽皂苷單因素試驗設計

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品吸收曲線及標準曲線的繪制

向20 mL具塞試管中分別加入對照液0、0.15 mL，75 ℃水浴揮干溶液，分別加入3%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸0.2、0.8 mL，75 ℃水浴反應15 min，再放入冰水充分冷卻后加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后靜置4 min，以相同溶劑在相同操作下作為空白對照，掃描間隔為1 nm，結(jié)果見圖1。確定最佳吸收波長為551 nm。分別取對照液0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 mL按相同預處理在551 nm處測定吸光度。以縱坐標為吸光度y，橫坐標為濃度C，繪制標準曲線，方程為y=19.001C-0.075 1，R2=0.999 6(圖2)。

圖1 吸收曲線

圖2 人參皂苷Rb1標準曲線

2.2 不同因素對皂苷提取率的影響

2.2.1 提取溫度對皂苷含量的影響 在溫度較低時皂苷溶解度不高，溶液中皂苷含量不高，當溫度超過一定時，溶液副反應程度增大導致皂苷含量偏低，故呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3)。

圖3 提取溫度

2.2.2 提取時間對皂苷含量的影響 當提取時間較短時，冬瓜籽中皂苷成份提取不完全，其含量隨著時間的增大而增大，但當提取時間過長時，皂苷會在強酸、強堿環(huán)境下發(fā)生降解，導致皂苷含量降低，所以皂苷含量隨著時間的增大其含量先上升后下降(圖4)。

圖4 提取時間

2.2.3 液料比對皂苷含量的影響 當提取溶劑較少時，皂苷提取速率會降低，導致皂苷含量較低，當提取溶劑較多時皂苷提取速率也會隨之增大，所以當液料比增大時，皂苷含量也會隨之增大最后趨于穩(wěn)定(圖5)。

圖5 液料比

2.3 正交試驗設計

由上述試驗結(jié)果可以得出，當提取溫度為90 ℃，提取時間為180 min,液料比為1∶20時皂苷提取得率較好。為確定半仿生法優(yōu)化冬瓜籽皂苷提取最佳試驗條件，采用L9(34)正交試驗表，以冬瓜籽皂苷含量為指標進行試驗(表2～3)。

表2 冬瓜籽皂苷正交試驗表

表3 冬瓜子皂苷正交試驗方差分析表

注:〔*〕表示在F[0.05]顯著；〔**〕表示在F[0.01]顯著。

由極差分析可以得出各自影響因素強弱為RC>RA>RB，故最優(yōu)組合為C2、A2、B3，即液料比為1∶20,時間為180 min,溫度為90 ℃。

3 結(jié)論與討論

半仿生法通過模擬機體內(nèi)部環(huán)境，模仿藥物在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程[9]，并且在酸性和堿性環(huán)境下提取可以使有效成分損失較少[10]。酸或堿能破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能讓細胞壁進一步水解，故能夠提高提取效率[11]。本文用半仿法和正交試驗優(yōu)化冬瓜籽中皂苷提取工藝[12]。通過單因素試驗確定各因素最佳考察范圍。從溫度和時間對冬瓜籽皂苷含量影響的單因素試驗可以看出，其濃度隨著溫度和時間的增大先上升后下降，在提取溫度較低時冬瓜籽皂苷隨著溫度的增大其溶解度增大故皂苷含量增大，但當溫度過高時皂苷含量降低較為明顯，這可能是冬瓜籽皂苷在高溫時發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化[13]，冬瓜籽皂苷中含有親水性基團，從而使其在濃度隨時間的增加而增大，但在此試驗環(huán)境下通過緩沖液調(diào)節(jié)pH值至強酸性或弱堿性，而強酸性、弱堿性環(huán)境可以使皂苷降解，隨著時間的增加其含量降低，故提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。隨著液料比的增加，皂苷含量先上升后保持不變，在強酸堿環(huán)境中可以促進植物細胞壁水解，故當提取時間、溫度一定時，皂苷含量隨著液料比的增加先上升后基本不變。對最佳試驗范圍用正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝，結(jié)果顯示當液料比為1∶20、提取時間和溫度分別為180 min、90 ℃時，皂苷提取得率達0.52%。半仿生法提取優(yōu)化一種冬瓜籽皂苷最佳提取工藝操作簡單結(jié)果穩(wěn)定可靠。