張金波 呂冬霞 鐘健 盧春鳳

(佳木斯大學 1基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007；2 2017級臨床7班)

納米氧化銅具有熱穩(wěn)定性、催化性能和一定的抗菌效應，因此可用于抗菌材料、生物醫(yī)學陶瓷材料、光學電子、催化劑、廢水處理等行業(yè)中〔1～5〕。由于眾多的納米氧化銅產(chǎn)品開發(fā)和利用，它已不可控地分布于空氣、水、土壤中，生物體會通過皮膚、呼吸道等多種途徑攝入，因此，納米氧化銅是否會給生物體帶來影響已成為生物醫(yī)學領域研究的熱點問題。肝臟作為消化系統(tǒng)的重要器官，具有清除體內(nèi)外毒性物質(zhì)、保護機體免受毒素侵襲的作用。肝臟、脾臟、腎臟等臟器是納米顆粒蓄積的部位，因此，納米氧化銅蓄積可能對肝臟造成一定的影響。人肝癌HepG2細胞分化程度較高，具有較完整的代謝系統(tǒng)，可作為評價化學危險性的理想體外模型〔6〕。因此，本研究以HepG2細胞為細胞模型，通過對細胞增殖活性和乳酸脫氫酶(LDH)的檢測探索納米氧化銅的毒性作用，為納米氧化銅的安全性評估和合理地應用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 HepG2細胞:購自中國科學院上海生命科學研究院。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱:上海易亮醫(yī)療器械有限公司，激光共聚焦顯微鏡:日本Olympus公司，全自動多功能酶標儀:美國Bio Tek公司。納米氧化銅顆粒:球狀，直徑40 nm，杭州萬景新材料有限公司。二甲基亞砜(DMSO):美國Sigma公司，改良型杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清:美國Gibco公司，LDH試劑盒：南京建成生物有限公司，胰蛋白酶、CCK-8試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。納米氧化銅顆粒懸液的配制：用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解1 mg納米氧化銅顆粒粉末，超聲振蕩至完全溶解，高壓蒸汽滅菌后密封，4℃冷藏；用無血清培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度待用。

1.2細胞培養(yǎng)與染毒 將細胞懸液加入到6孔板，每孔加入2 ml，接種密度是1×105/ml，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml的納米氧化銅顆粒處理細胞，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3形態(tài)學改變 將細胞懸液以1×105/ml加入到6孔板中，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，24 h 后，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.4Hoechst33258細胞核染色 將細胞懸液以1×105/ml加入到6孔板中，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，PBS 液沖洗，用4%甲醛室溫下固定15 min，PBS沖洗，染色液染色15 min，PBS沖洗，運用激光共聚焦顯微鏡顯示細胞核形態(tài)變化。

1.5細胞活性的CCK-8法測定 將細胞懸液以8×104/ml加入96孔板，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞，培養(yǎng)24 h后加入CCK-8 10 μl，培養(yǎng)2 h后使用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。每組設定4個復孔。

1.6細胞膜完整性的測定 將細胞懸液以8×104/ml加入96孔板，培養(yǎng)24 h后把培養(yǎng)液棄去，用濃度是0(對照)、25、50、100、200 μg/ml 的納米氧化銅顆粒處理細胞24 h，按照試劑盒說明書對細胞上清液中LDH活力進行檢測。每組設6個復孔。

1.7統(tǒng)計學方法 運用SPSS17.0 軟件，多組間比較采用單因素方差分析和方差齊性檢驗。進一步進行組間兩兩比較，若方差齊時，采用SNK檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell 檢驗；率的比較采用χ2檢驗。兩組比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1細胞形態(tài)學變化 對照組細胞呈正常的梭形，細胞貼壁生長，外形規(guī)則，輪廓清晰；染毒濃度是25 μg/ml時，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，開始變圓；染毒濃度達50 μg/ml時，細胞變形明顯，變小變圓，輪廓不清楚，細胞間隙增大；染毒濃度達到100 μg/ml時，細胞變成圓形，胞質(zhì)不通透，細胞生長狀態(tài)差，不能牢固貼壁，部分細胞漂浮在細胞液中，可見細胞碎片。見圖1。

圖1 不同濃度納米氧化銅染毒后HepG2細胞的形態(tài)變化(×200)

2.2細胞核染色 對照組細胞核呈長圓形，外形規(guī)則，輪廓清楚；染毒濃度是25 μg/ml時，部分細胞核可見染色質(zhì)呈凝集狀態(tài)，染毒濃度達50、100 μg/ml時，細胞核縮小，染色質(zhì)凝集程度變高，發(fā)生凋亡改變。見圖2。

2.3細胞活性的檢測結(jié)果 25、50、100、200 μg/ml的納米氧化銅處理細胞后，細胞存活率分別為(88.30±5.58)%，(85.68±3.91)%，(64.93±2.95)%，(47.73±1.98)%，對照組(0 μg/ml組)細胞存活率為100%。不同濃度納米氧化銅染毒組HepG2細胞的存活率與對照組相比均明顯降低(P<0.05)；細胞存活率隨著納米氧化銅染毒濃度的上升呈下降趨勢。

圖2 不同濃度納米氧化銅染毒后細胞核形態(tài)變化(Hoechst33258染色，×10)

2.4細胞膜完整性的測定結(jié)果 0、25、50、100 μg/ml納米氧化銅處理細胞后，細胞上清液中LDH活力分別為(667.83±6.06)、(824.28±27.30)、(1 315.62±23.04)、(1 792.30±10.20)μg/ml。25、50、100 μg/ml納米氧化銅組HepG2細胞LDH的活力與對照組(0 μg/ml組)相比均升高(P<0.01)；細胞中LDH活力隨著納米氧化銅染毒濃度升高呈上升趨勢。

3 討 論

當化合物或顆粒在三維空間的尺寸至少有一個維度在1～100 nm就稱納米粒子〔7〕。由于其具有特殊的理化性質(zhì)〔8〕，現(xiàn)已用于生物醫(yī)藥、機械環(huán)保、電子、化妝品等領域〔9〕。納米氧化銅具有良好的分散性、熱穩(wěn)定性、抑菌性能、催化特性等特點，被用于半導體、抗菌制劑和催化劑等領域〔10〕。已有研究表明，納米氧化銅能夠?qū)C體產(chǎn)生毒性效應〔11〕。所以，研究納米氧化銅對生物體的毒性效應更加重要，豐富納米材料毒性的理論數(shù)據(jù)，可為其科學、合理的應用和安全處理提供理論論據(jù)〔12〕。

納米粒子具有特殊的理化性能，使其更容易通過細胞膜而進入細胞〔13,14〕，引起細胞形態(tài)發(fā)生一定變化。Gong等〔15〕認為納米粒子會對細胞膜造成一定損害，使細胞皺縮，無法牢固貼壁。李娜〔16〕發(fā)現(xiàn)納米氧化銅處理 A549細胞后，細胞發(fā)生明顯的形變，納米氧化銅可分布于細胞質(zhì)、溶酶體、線粒體及細胞核等細胞器中。Wang 等〔17〕研究表明，納米氧化銅能夠到達溶酶體膜，對其破壞。本實驗結(jié)果也表明納米氧化銅達到一定濃度對細胞具有一定的毒性。隨著納米氧化銅染毒濃度增加，可見凋亡的特征性改變，如染色質(zhì)高度凝集、核固縮等。

研究顯示〔18,19〕，納米氧化銅會影響細胞增殖活性，使細胞產(chǎn)生過多的氧自由基(ROS)，啟動細胞凋亡。本研究證實，納米氧化銅染毒組細胞存活率明顯降低，且隨著納米氧化銅染毒濃度的上升呈下降趨勢。Maqsood等〔20〕用22 nm的氧化銅作用于HepG2細胞，細胞存活率也會下降，且與納米氧化銅濃度呈正比，與本實驗結(jié)果相符。

LDH存在于活細胞胞質(zhì)中，能夠把乳酸催化成丙酮酸。正常細胞會將少量LDH釋放到細胞外，如果細胞膜遭到破壞，LDH會大量釋放到細胞外液中，所以細胞膜是否受損可以通過細胞外液中LDH的活力來判斷。實驗證明，納米氧化銅染毒組LDH的活力明顯升高，且隨著納米氧化銅染毒濃度升高呈上升趨勢。說明納米氧化銅顆粒能使細胞膜發(fā)生損傷，使細胞的增殖受到抑制引起死亡。Akhtar等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，5～15 μg/ml納米氧化銅顆粒作用于小鼠胚胎成纖維細胞BALB 3T3，LDH活性顯著增高，表明納米顆粒能損害細胞膜，對細胞具有劑量相關(guān)性毒性效應，與本研究結(jié)果相符。

綜上所述，40 nm氧化銅顆粒能抑制HepG2細胞增殖,使細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞膜發(fā)生損傷，對細胞產(chǎn)生毒性效應。