余佳敏，孔垂旭，肖 勇，余祥文，白夢嬌，王 蓉，張海華

(1.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610041；2.云南綠葉生防科技有限公司，云南 玉溪 653100)

【研究意義】蠐螬(White grubs)是鞘翅目(Coleoptera)金龜子總科(Scarabaeoedea)幼蟲的統(tǒng)稱，是地下害蟲中造成植物損失最大的一大重要類群(Chen et al.，2008)，其食譜廣泛，涉及植物涵蓋烤煙、大豆、花生、小麥、馬鈴薯、蔬菜、中藥材、苗圃、果樹、草坪等[2]。蠐螬取食煙株根部，常造成缺苗、斷壟或幼苗生長不良[3]，據(jù)相關統(tǒng)計，煙株移栽期因蠐螬取食造成煙苗死亡率達5 %～20 %，近年來，隨著煙田有機肥的增施，農(nóng)田林網(wǎng)化的加速發(fā)展，蠐螬生境越發(fā)適宜，使得蠐螬的發(fā)生與為害呈現(xiàn)出逐年加重的趨勢[4]，嚴重影響了烤煙的正常生產(chǎn)及煙農(nóng)種煙的積極性[3]，因此防治工作已迫在眉睫。目前，防治蠐螬效果較好的化學農(nóng)藥有：辛硫磷、甲基異柳磷、丁硫克百威、吡蟲啉、毒死蜱、敵百蟲[5]，但由于蠐螬生境較為隱蔽，在一定范圍內(nèi)具逃避化學藥劑的能力[1]，化學藥劑常常出現(xiàn)防效差且不穩(wěn)定的現(xiàn)象，此外，長期使用化學農(nóng)藥，還會帶來藥物殘留高、抗藥性增加、土壤理化性質(zhì)惡化、環(huán)境污染等一系列負面問題[2, 6]。生物防治“以菌治蟲，以蟲治蟲”的策略，不僅具有選擇性高、安全性好、對生態(tài)系統(tǒng)影響小、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，而且天敵昆蟲還有主動搜尋害蟲的特性，在一定程度上能避免害蟲對化學藥劑的躲避[1]，因此生物防治備受關注?！厩叭搜芯窟M展】目前，用于蠐螬生防領域的防控因子主要有：昆蟲病原細菌、昆蟲病原真菌、昆蟲病原線蟲等。昆蟲病原細菌中應用最為廣泛的是蘇云金芽孢桿菌(Bt)，如2000年馮書亮等[7]研究發(fā)現(xiàn)Bt HBF-1菌株對褐異麗金龜1～2齡幼蟲的毒殺作用，14 d時致死率達100 %，2008年劉興龍等[8]研究發(fā)現(xiàn)1株對暗黑齒爪鰓金龜、琉璃弧麗金龜、柳葉跳甲等幼蟲具有殺蟲活性的菌株B-DLL，并對其晶體蛋白基因進行了克隆，取得了顯著的防治效果，并正式命名為cry8Ea2；生產(chǎn)中防治蠐螬應用較多的昆蟲病原真菌是白僵菌和綠僵菌，如安徽省農(nóng)業(yè)技術推廣總站曾利用2 %白僵菌粉制劑防治花生蠐螬，防效可達65.4 %～69.2 %，增產(chǎn)率在15 %以上[9]，又如陳正州等[10]將球孢白僵菌與麥麩進行復配用于防治田間花生蠐螬，防效超過了70 %；謝寧、申劍飛和殷幼平等篩選出蠐螬高致病力金龜子綠僵菌菌株CQMa128、CQM132和CQM135，其中CQMa128已生產(chǎn)出微粒劑和乳粉劑等劑型，可有效控制田間蠐螬對花生的危害[11]。蠐螬是昆蟲病原線蟲首次應用于害蟲防治的靶標，也是昆蟲病原線蟲應用研究最為廣泛的地下害蟲[12]，如許艷麗等[13]對H.bacteriophoraNJ線蟲進行了溫室盆栽試驗，結果發(fā)現(xiàn)H.bacteriophoraNJ線蟲劑量為5 IJs /cm2、連續(xù)施用2～3次可對東北大黑鰓金龜幼蟲進行，防治效果高達71.4 %。雖然上述3種蠐螬生防因子的研究應用都取得了顯著的成效，但在應用過程中均具有一些局限性，如①BT毒力不強、殺蟲譜窄、持效期和貨架期短、害蟲產(chǎn)生抗性等[14]；②土壤抑菌作用會嚴重影響昆蟲病原真菌對蠐螬的防治效果[15]；③同種昆蟲病原線蟲對不同蠐螬種類的敏感度的差異較大，單獨施用效果常常不穩(wěn)定[12]。因此需要綜合考慮各生防因子的利弊，將各生防因子進行有機結合，才能顯著提高防治效果。【本研究切入點】本研究將前期篩選的對蠐螬具有較高活性的白僵菌Bbn6菌株與昆蟲病原線蟲P01線蟲聯(lián)合使用來防治煙草蠐螬進行室內(nèi)測試及田間應用驗證，進一步探索2種生防因子間的協(xié)同增效機制?！緮M解決的關鍵問題】為煙草蠐螬生物防治提供理論依據(jù)與實踐指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試線蟲：Pellioditisspp. P01(以下簡稱為P01)，2015年于攀枝花仁和區(qū)大龍?zhí)兑妥遴l(xiāng)干壩子村板栗樹的根際土壤誘集得到。供試昆蟲：暗黑鰓金龜幼蟲，2017年于攀枝花仁和區(qū)干壩子村煙田采集的暗黑鰓金龜幼蟲經(jīng)室內(nèi)飼養(yǎng)獲得；大蠟螟幼蟲，購于成都張氏蟲業(yè)，10 ℃保存?zhèn)溆?。供試菌株：白僵?Beauverbassiana)Bbn6(以下簡稱為Bbn6)，2017年于攀枝花仁和區(qū)干壩子村采集的煙田感病金針蟲分離純化得到，保存于云南綠葉生防科技有限公司。供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、改良查氏液體培養(yǎng)基，用于Bbn6的活化及發(fā)酵液的制備，配置方法參照文獻[16]。供試設備：RXZ-160A-LED 型人工氣候培養(yǎng)箱，購于寧波江南儀器廠；FCD-211XF型冰箱，購于青島海爾特種電冰柜有限公司。供試作物：烤煙‘云煙87’，由四川省煙草公司攀枝花市公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 P01線蟲懸浮液的制備 采用濾紙侵染法培養(yǎng)P01線蟲，即：在放有雙層滅菌濾紙的6 cm塑料培養(yǎng)皿中接入5頭大蠟螟末齡幼蟲，按100 IJs/頭大蠟螟的接種量接入P01侵染期線蟲，25 ℃下侵染48 h，待大蠟螟死亡后，將其放于線蟲收集皿上，5 d后逐日收集線蟲懸浮液，用無菌水配置成100、200、400 IJs/mL的線蟲懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 暗黑鰓金龜幼蟲的飼養(yǎng) 飼養(yǎng)方法參照文獻[2]，略有改動。采集暗黑鰓金龜成蟲帶回室內(nèi)用塑料餐盒飼養(yǎng)。塑料餐盒底鋪一層過40目篩的厚度約為5 cm、濕度15 %左右的滅菌細砂，放入適量幼嫩的煙葉作飼料，并蓋上用繡花針打有10個小孔的蓋子。待成蟲交配產(chǎn)卵后將卵轉(zhuǎn)移至到裝有滅菌細砂的培養(yǎng)皿中(濕度為15 %左右)，在 25 ℃左右的人工氣候箱中統(tǒng)一孵化，幼蟲在裝有15 %濕度滅菌細砂的塑料餐盒中飼養(yǎng)，每盒5頭，以0.5 cm3大小的馬鈴薯切塊飼養(yǎng)至1齡期保存?zhèn)溆?，為保證濕度以及充足的飼料，每隔2周對細砂和馬鈴薯進行一次更換。

1.2.3 Bbn6發(fā)酵液的制備 制備方法參照文獻[17]，略有改動。在無菌條件下向直徑6 cm滅菌的PDA平板培養(yǎng)基上接入1 cm×1 cm 白僵菌Bbn6菌塊，接種完成后轉(zhuǎn)至25 ℃的恒溫箱中進行暗培養(yǎng)7 d后，待Bbn6長滿整個平板，用直徑5 mm的打孔器打2 個菌餅轉(zhuǎn)接至50 mL 已滅菌改良查氏液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，于25 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d(此時孢子濃度約為108CFU/mL)，置于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 不同劑量P01線蟲對蠐螬1齡幼蟲致病力的室內(nèi)測試 采用土壤處理法測試P01線蟲對蠐螬1齡幼蟲的毒力，測試方法參考文獻[2]、[18]，略有改動，試驗在溫度為 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工氣候培養(yǎng)箱(RXZ-160A-LED)中進行(光周期24 h，Day∶Night=6∶18)。在普通塑料餐盒中平鋪入5 cm 厚的滅菌細砂(含水量約15 %)和一定量的0.5 cm3大小的馬鈴薯切塊，將蠐螬的1齡幼蟲分別放入盒中，每盒加入5頭體型一致且健康的蠐螬1齡幼蟲作為一個處理，然后分別滴加不同濃度梯度(100、200、400 IJs/mL)的線蟲懸浮液5 mL，以滴加等量滅菌水的處理作為對照，每處理3平行，每24 h 檢查蠐螬的死亡情況，檢查至12 h，記錄死亡率并計算校正死亡率。

1.2.5 Bbn6發(fā)酵液對蠐螬1齡幼蟲毒力的室內(nèi)測試 采用細砂處理法對蟲體進行接菌，測試方法參考文獻[19]，將上述1.2.3的10 mL(相當于田間每穴的用量)Bbn6發(fā)酵液拌厚度5 cm的滅菌細砂并轉(zhuǎn)移至塑料餐盒內(nèi)。每餐盒接入10頭蠐螬作為1個處理，每處理3次重復，以嫩煙葉作為飼料飼養(yǎng)，以無菌水為空白對照。處理完成后轉(zhuǎn)移至溫度為 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工氣候培養(yǎng)箱(RXZ-160A-LED)中，每3 d觀察1次，計算累計死亡率和校正累計死亡率。

1.2.6 Bbn6對P01線蟲致病力的室內(nèi)測試 測試方法參考文獻[17]，取滅菌60 mm的玻璃培養(yǎng)皿，加入2 mL的無菌水及1 mL 200 IJS/mL的線蟲懸浮液，然后加入1 mL 108 CFU/mL Bbn6發(fā)酵液，對照用3 mL無菌去離子水及1 mL的懸浮液200 IJS/mL的線蟲懸浮液，輕輕搖動使其充分混勻，每處理3 次重復，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，分別于 24、48 h 鏡檢并記錄供試線蟲總數(shù)和死亡數(shù)， 并計算線蟲死亡率和校正死亡率。

線蟲死亡率=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù) × 100 %。

校正死亡率=(處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率)× 100 % 。

1.2.7 P01與Bbn6防治蠐螬聯(lián)合作用的室內(nèi)測試 將10 mLBbn6發(fā)酵液拌厚度5 cm的細砂，攪拌均勻后移至塑料餐盒內(nèi)，滴加10 mL P01侵染期3齡幼蟲(400 IJS/mL)，每餐盒接入10頭蠐螬作為1個處理，每處理3次重復，以嫩煙葉作為飼料飼養(yǎng)，并設P01、Bbn6單用處理，以無菌水處理為空白對照。處理完成后轉(zhuǎn)移至溫度為 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工氣候培養(yǎng)箱(RXZ-160A-LED)中，每24 h觀察1次，計算累計死亡率和校正累計死亡率。

1.2.8 P01與Bbn6防治蠐螬聯(lián)合作用的田間測試 試驗于2017年5-9月在攀枝花仁和區(qū)大龍?zhí)兑妥遴l(xiāng)干壩子村起德洪家煙田進行，往年蠐螬發(fā)生較嚴重，采用起壟覆膜的栽培模式，5月12日移栽，株行距：0.5 m×1.2 m。試驗設4個處理，處理P01：單獨施用P01線蟲，用量為4000條/穴；處理Bbn6：單獨施用Bbn6發(fā)酵液，用量為10 mL/穴；處理P01+Bbn6：同時施用P01線蟲與Bbn6發(fā)酵液，用量同于T1、T2；處理CK：空白對照。每處理3次重復，共12個小區(qū)，每小區(qū)植煙90株。于烤煙打頂期(7月12日)調(diào)查各處理的烤煙主要農(nóng)藝性狀，調(diào)查方法同于文獻[19]，煙葉采收結束(9月12日)，采用 5 點取樣法，每點調(diào)查 5株，共25株，記載蠐螬(活體)頭數(shù)，計算蟲口減退率，計算公式如下。

蟲口減退率( %)= (對照區(qū)蟲數(shù)-處理區(qū)蟲數(shù))×100/對照區(qū)蟲數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，DPS7.0軟件進行顯著性檢驗，Duncan氏新復極差法進行多重比較[19]。

2 結果與分析

2.1 P01線蟲對蠐螬1齡幼蟲的致病力

3種濃度的P01線蟲對暗黑鰓金龜1齡幼蟲的致病力結果詳見圖1。隨著線蟲侵染寄主時間的延長及線蟲劑量的增加，暗黑鰓金龜1齡幼的校正死亡率呈逐步增長的趨勢，72 h前以400 IJS/mL的增強趨勢最明顯，校正死亡率達86.67 %，且96、120 h時400 IJS/mL濃度的P01線蟲對暗黑鰓金龜1齡幼的校正死亡率均達100 %。說明P01線蟲對暗黑鰓金龜1齡幼蟲的最適致死濃度為400 IJS/mL。

圖1 不同濃度的P01線蟲對蠐螬1齡幼蟲的致病力Fig.1 Pathogenicity of different concentrations of P01 nematodes to white grubs in the first instar larvae

圖2 不同濃度的Bbn6發(fā)酵液對蠐螬1齡幼蟲的致病力Fig.2 Pathogenicity of different concentrations of Bbn6 fermented liquid to white grubs in the first instar larvae

2.2 Bbn6發(fā)酵液對蠐螬1齡幼蟲毒力的室內(nèi)測試

3種濃度的Bbn6發(fā)酵液對暗黑鰓金龜1齡幼蟲的致病力結果詳見圖2。隨著時間的延長及Bbn6發(fā)酵液濃度的增加，暗黑鰓金龜1齡幼的校正死亡率呈逐步增長的趨勢，處理后的3～15 d，1×108CFU/mL的Bbn6發(fā)酵液對暗黑鰓金龜1齡幼蟲的校正死亡率均高于1×107、1×106CFU/mL的Bbn6發(fā)酵液，說明Bbn6發(fā)酵液對暗黑鰓金龜1齡幼的最佳致死濃度為1×108CFU/mL。

2.3 Bbn6對P01線蟲致病力的室內(nèi)測試

如表1所示。24～120 h，Bbn6發(fā)酵液對P01線蟲的校正死亡率在0.33 %～4.71 %之間，且與改良查氏液體培養(yǎng)基對照的校正死亡率無明顯差異，說明Bbn6對P01線蟲的毒力較小。

2.4 P01與Bbn6防治蠐螬的聯(lián)合作用

400 IJS/mL P01線蟲與1×108CFU/mL Bbn6發(fā)酵液防治蠐螬的聯(lián)合作用的室內(nèi)測試結果詳見圖3。處理后24～96 h，隨著時間的延長，各處理對暗黑鰓金龜1齡幼蟲的校正死亡率呈逐漸增長的趨勢，72 h前以處理P01、處理P01+Bbn6的增長趨勢較明顯，24、48、72 h P01+Bbn6對暗黑鰓金龜1齡幼的校正死亡率為36.67 %、63.33 %、96.67 %，且顯著高于P01單獨處理及Bbn6單獨處理，處理96 h后P01+Bbn6對暗黑鰓金龜1齡幼的校正死亡率達100 %。

圖3 P01與Bbn6防治蠐螬的聯(lián)合作用的室內(nèi)測試Fig.3 Laboratory test on combination effect of P01 and Bbn6

P01線蟲與白僵菌Bbn6聯(lián)合防治煙草蠐螬田間試驗結果詳見表2。施藥后61 d，P01+Bbn6混合處理的株高與P01單用處理、Bbn6單用處理之間差異不顯著；在莖圍、最大葉長、最大葉寬方面，均以P01+Bbn6混合處理最好，P01單用處理、Bbn6單用處理之間差異不顯著。藥后123 d，蟲口數(shù)最高的為CK處理216.7頭/cm3，蟲口數(shù)最低的為處理P01+Bbn6 56.0頭/m3，P01單用處理、Bbn6單用處理的蟲口數(shù)分別為109.3、118頭/m3。蟲口減退率以P01+Bbn6混合處理最高為73.69 %，其次為P01單用處理，蟲口減退率為49.19 %，最低的為Bbn6單用處理，蟲口減退率為45.05 %。

表1 Bbn6對P01線蟲致病力

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示不同處理在0.01、0.05水平差異顯著，下同。

Note：The different lowercase letters within the same column indicate significant difference (P<0.05), different capitals mean extremely significant difference (P<0.01); The same as below.

表2 P01線蟲與白僵菌Bbn6協(xié)同作用防治煙草蠐螬

綜上所述，P01線蟲與白僵菌Bbn6在防治煙草蠐螬中具有明顯的協(xié)同增效作用，P01線蟲與白僵菌Bbn6混合使用，既能顯著改善烤煙的農(nóng)藝性狀，又能顯著降低煙草蠐螬的為害。

3 討 論

不同白僵菌菌株的發(fā)酵液對昆蟲病原線蟲的毒力存在差異，如陳立杰等[20]研究了20 株白僵菌發(fā)酵液對小桿線蟲的生物活性，發(fā)現(xiàn)大多白僵菌菌株對小桿線蟲均具有較高的致死率，只有B51、B701085菌株對小桿線蟲的毒性較小，本研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌Bbn6發(fā)酵液對小桿線蟲P01的毒力較小，24～120 h的校正死亡率在0.33 %～4.71 %，這可是因為本研究中Bbn6與B51、B701085菌株在遺傳方面存在高度相似性，但這一假設還需要對Bbn6與B51、B701085的DNA序列進行比對進一步確定。

400 IJS/mL P01線蟲對暗黑鰓金龜1齡幼96 h校正致死率達100 %，而田間防治效果僅為49.19 %，這可能與施用方法或線蟲的使用劑量較少有關，因為昆蟲病原線蟲對濕度比較敏感，過于干燥會對線蟲產(chǎn)生不利的影響[21]，本實驗中采取是先施線蟲后澆水的方法，相關研究結果證實，采取先澆地后再施線蟲的方法能提高昆蟲病原線蟲的防治效果[22-23]，在田間應用中，一般說來，隨著使用劑量的加大，線蟲對寄主昆蟲的寄生能力隨之提高[24-26]，因此可否通過增加小桿線蟲P01的用量來提高煙草蠐螬的防治效果，還需要大量的試驗進行驗證。

田間試驗結果表明，P01線蟲與白僵菌Bbn6聯(lián)合使用煙草蠐螬的防治效果高達73.69 %，顯著高于P01線蟲單用處理、白僵菌Bbn6單用處理，這與國外聯(lián)合利用綠僵菌與小桿線蟲防治草地蠐螬之間存在協(xié)同增效作用的結果相一致[27]，這為田間利用昆蟲病原線蟲與地下害蟲生防真菌混用防治煙草蠐螬的可行性提供了科學依據(jù)，但兩者之間的協(xié)同增效機制還需要大量的研究進行探索。

4 結 論

研究結果表明，白僵菌Bbn6發(fā)酵液對P01線蟲的毒力較小，無論在室內(nèi)還是大田，白僵菌Bbn6與P01混合使用防治蠐螬的防治效果均顯著高于P01單用和Bbn6單用，因此昆蟲病原線蟲P01與白僵菌Bbn6之間存在顯著的協(xié)同增效作用，為田間利用昆蟲病原線蟲與地下害蟲生防真菌混用防治煙草蠐螬的可行性提供科學依據(jù)。