李元元，楊蒙迪，曹紅星，李新國*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；2.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 ?？?570228)

【研究意義】油棕(ElaeisguineensisJacq.)屬棕櫚科多年生的熱帶木本油料作物，每公頃產(chǎn)油量高達(dá)6～8 t，被稱為“世界油王”[1]。根據(jù)其果實(shí)的結(jié)構(gòu)和含油量不同，油棕分為厚殼種Dura，無殼種Pisifera和薄殼種Tenera三類[2]。不同植物種類的花粉在長期的進(jìn)化過程中，經(jīng)過不斷演化和發(fā)展往往形成獨(dú)特的形態(tài)特征[3-4]。植物的花粉作為較為保守的繁殖器官的一部分，其結(jié)構(gòu)由物種的基因所決定，受環(huán)境影響很小[5-6]，其形態(tài)特征具有很強(qiáng)的遺傳性，是研究植物演化和分類的重要依據(jù)之一[7]?；ǚ鄞笮?、形狀、對稱性和極性，花粉萌發(fā)孔的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和位置，花粉壁的結(jié)構(gòu)以及表面雕紋等，可為植物系統(tǒng)發(fā)育的研究提供科學(xué)依據(jù)[8]。電子顯微鏡能夠?qū)ξ⒂^特征包括花粉萌發(fā)孔和溝的位置、數(shù)目以及外壁結(jié)構(gòu)、雕紋式樣等方面的細(xì)微差異進(jìn)行觀察，從而為某些疑難類群的分類劃界和系統(tǒng)定位提供了頗有價值的信息[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，利用SEM觀察植物花粉形態(tài)的研究已有很多，如“黃金蜜柚”[10]、薄殼山核桃[11]、獼猴桃[12]、油茶[13-14]、大戟科不同屬不同種植物[15]等。20世紀(jì)80年代，已有學(xué)者對國產(chǎn)棕櫚科的花粉形態(tài)進(jìn)行研究[16]。但對油棕花粉微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究少見報道。MYB(myeloblastosis)蛋白在植物生理代謝和發(fā)育過程中廣泛地參與調(diào)節(jié)[17-18]。AtMYB125/DUO1是一個控制雄性生殖細(xì)胞分裂和分化的花粉特異因子[19]。GPI的生物合成也是花粉萌發(fā)和花粉管生長所必需的[20]。但在油棕的花粉萌發(fā)過程中有關(guān)MYB及GPI等相關(guān)基因的研究還少見報道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過對3種類型油棕花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察及對花粉萌發(fā)前后相關(guān)基因的表達(dá)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】可以為油棕的品種鑒定、系統(tǒng)分類和從分子水平上揭示了花粉萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制等奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)的油棕花粉來源于海南省文昌市的中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所油棕資源圃內(nèi)的厚殼種Dura、薄殼種Tenera和無殼種Pisifera等3種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉采集及SEM觀察 2017年9-10月，采摘3種果殼類型的油棕雄花序并在采摘當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，輕輕將花粉抖落在鋪有硫酸紙的實(shí)驗(yàn)臺上，再將花粉進(jìn)行過篩處理，篩孔徑為0.1 mm。將過篩處理后的花粉在38 ℃烘箱中干燥36 h，隨后花粉用干燥好的離心管等密封容器盛放保存在-20 ℃冰箱內(nèi)備用[21]。

將干燥后的供試花粉粒分別用牙簽均勻彈在黏有雙面導(dǎo)電膠的金屬載臺上，放入SBC-12型離子濺射儀中噴金，然后置于德國ZEISS掃描電子顯微鏡下觀察，選取典型的花粉粒進(jìn)行拍照。用CAD軟件測量花粉粒大小，每種花粉粒測量10粒，求平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 利用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。采用Takara試劑盒，將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈。

1.2.3 qRT-PCR 本研究運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定一些基因在3種果殼類型油棕花粉萌發(fā)前后及授粉后不同時間點(diǎn)的油棕雌花中的相對表達(dá)量，選擇穩(wěn)定性較好的看家基因Actin作為內(nèi)參基因(表1)。

以上引物均委托廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成。

10 μl反應(yīng)體系含有5.0 μl SYBR?Select Master Mix、0.5 μl Primer(F)、0.5 μl Primer(R)、1.0 μl(100 ng/μl)cDNA、3.0 μl ddH2O。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SAS(Statistical Analysis System)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，在α=0.01水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的外部形態(tài)特征

2.1.1 大小與形態(tài)結(jié)構(gòu) 由圖1～3可知，3種類型的油棕花粉形態(tài)非常相似，均以單粒形式存在，形狀為邊緣光滑的近正三角形。厚殼種花粉的平均邊長為32.86 μm，薄殼種的為32.51 μm，無殼種的為33.87 μm，差異不顯著(表2)。

2.1.2 外壁紋飾與萌發(fā)孔溝 3種果殼類型的油棕花粉外壁均具網(wǎng)脊，屬于細(xì)網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼成淺穴狀或兼具不規(guī)則小穿孔，萌發(fā)孔周圍的網(wǎng)狀紋飾較稀疏。具3條大致沿正三角形3個頂角的角平分線方向分布的孔溝。由圖1～3可以看出，薄殼種花粉形態(tài)與厚殼種和無殼種的不同，薄殼種背部網(wǎng)紋較平滑，而厚殼種和無殼種的凸起。

表1 所測引物及序列

圖1 厚殼種Dura花粉形態(tài)Fig.1 Pollen morphology of Dura

圖2 薄殼種Tenera花粉形態(tài)Fig.2 Pollen morphology of Tenera

圖3 無殼種Pisifera花粉形態(tài)Fig.3 Pollen morphology of Pisifera

2.2 花粉萌發(fā)前后的qRT-PCR檢測

不同果殼類型的油棕花粉萌發(fā)前后qRT-PCR檢測結(jié)果如圖4～6所示，同種基因在不同果殼類型的油棕花粉中表達(dá)情況不同，GPI-anchored基因在3種果殼類型的花粉中均有表達(dá)，且萌發(fā)3 h后表達(dá)量均下降，即該基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)，但下降幅度不同。MYB基因在萌發(fā)前的3種果殼類型花粉中均有表達(dá)，但萌發(fā)3 h后卻只在厚殼種花粉中檢測到表達(dá)，且為下調(diào)表達(dá)。MYB(x3)基因在萌發(fā)前后的3種果殼類型油棕花粉中均檢測到表達(dá)，但表達(dá)情況不同，厚殼種中萌發(fā)前后表達(dá)量相同，薄殼種中為下調(diào)表達(dá)，無殼種中為上調(diào)表達(dá)。

表2 3種果殼類型的油棕花粉大小

圖4 GPI-anchored基因在3種果殼類型油棕的萌發(fā)前后花粉中的表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of GPI-anchored gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

圖5 MYB基因在3種果殼類型油棕的萌發(fā)前后花粉中的表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of MYB gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

3 討 論

孢粉學(xué)是研究植物的孢子、花粉(簡稱孢粉)的形態(tài)、分類及其在各個領(lǐng)域中應(yīng)用的一門科學(xué)，它作為植物進(jìn)化中古老的學(xué)科，在揭示物種進(jìn)化上能提供穩(wěn)定、有效的證據(jù)[22]。花粉的形態(tài)特征不受外界條件影響，而受植物基因型控制，具有固定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，是探討植物起源、演化及親緣關(guān)系的重要特征之一[23]。為植物的系統(tǒng)分類與親緣關(guān)系鑒定等方面提供了重要依據(jù)[24]。

然而，在利用掃描電鏡觀察花粉形態(tài)特征的試驗(yàn)中，樣品制取方法卻不盡相同。原則上，我們要求試驗(yàn)材料保持其本來面目，故理論上用新鮮花粉直接觀察最好，但采集新鮮花粉直接觀察，在人力和物力上也存在困難；因而，在采用電鏡進(jìn)行花粉觀察之前，必須選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒒ǚ奂右员４?，分批采樣、集中保存、集中觀察[25]。Priambodo等研究了3種類型的油棕花粉形態(tài)和蛋白質(zhì)特性[26]，認(rèn)為油棕花粉形態(tài)為近似三角形。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種果殼類型的花粉粒均以單粒形式存在且其形態(tài)相似，均為邊緣光滑的近正三角形，邊長在29.70～37.68 μm之間，具3條萌發(fā)孔溝，外壁紋飾均為細(xì)網(wǎng)紋狀，萌發(fā)器官形態(tài)較為一致，充分反映了油棕物種的自然屬性。

圖6 MYB(x3)基因在3種果殼類型油棕的萌發(fā)前后花粉中的表達(dá)情況Fig.6 Relative expression of MYB (x3) gene in pollen grains of 3 different types of oil palm before and after germination

qRT-PCR技術(shù)是一種很好的檢測基因表達(dá)的方法，通過該技術(shù)可以分析植物在不同處理?xiàng)l件下基因樣本的表達(dá)差異，也可以分析植物在不同生長發(fā)育時期基因表達(dá)的差異[27]。趙和文等運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，通過觀察與褐化相關(guān)基因PPO和PAL在組織培養(yǎng)過程中不同時期的表達(dá)量及蝴蝶蘭組培苗培養(yǎng)不同階段中2個基因的表達(dá)差異研究，得出2個基因在培養(yǎng)的第12天表達(dá)量都達(dá)到最高，說明此時是褐化發(fā)生的關(guān)鍵時期，若此時期對其進(jìn)行有效預(yù)防措施，將會減少褐化現(xiàn)象[28]。劉霞宇等運(yùn)用qRT-PCR研究出金銀花花器官基因表達(dá)時可選用的內(nèi)參基因[29]。本研究發(fā)現(xiàn)同種基因在不同果殼類型中的表達(dá)情況是不同的，變化趨勢有的也不一致，也許是不同類型間的差異所致，也可能是因天氣或取樣情況的不同引起的。同種基因在不同果殼類型油棕的萌發(fā)前后花粉和授粉前后雌花中的表達(dá)情況不同，可知該基因在不同果殼類型的油棕中具有不同的作用。GPI-anchored在3種果殼類型萌發(fā)前后的油棕花粉中均有表達(dá)，且萌發(fā)后于萌發(fā)前為下調(diào)表達(dá)；MYB在萌發(fā)前的3種類型的花粉中均表達(dá)，但萌發(fā)后僅厚殼種中有表達(dá)。MYB(x3)在3種果殼類型萌發(fā)前后的油棕花粉中均有表達(dá)，厚殼種中萌發(fā)前后相對表達(dá)量相同，薄殼種中萌發(fā)后于萌發(fā)前為下調(diào)表達(dá)，無殼種中萌發(fā)后于萌發(fā)前為下調(diào)表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究用于掃描電鏡觀察的花粉僅進(jìn)行了干燥處理，未用其他化學(xué)藥品進(jìn)行處理，用于測量大小的花粉個數(shù)偏少。對萌發(fā)前后基因的表達(dá)情況也是通過查閱別人在其他作物上報道的基因，在油棕中通過BLAST比對獲得，因此對以上幾個基因在花粉萌發(fā)前后的作用仍需進(jìn)一步研究。