李 霞，杜 娟，楊曉夢，普曉英，楊加珍，曾亞文

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】云南是中國稻種最大的遺傳多樣性中心和亞洲栽培稻秈粳分化中心[1]，其中有色米資源十分豐富，幾乎占云南地方稻種資源的一半[2]。有色稻米種皮富含天然色素，具有很強(qiáng)的抗氧化性和自由基清除功能，在抗癌、抗炎癥、抗菌、保護(hù)視力、預(yù)防心血管疾病和糖尿病等方面都具有重要生理功能[3-5]。目前針對水稻種質(zhì)資源多樣性研究報(bào)道較多[6-8]，但對有色米遺傳多樣性的研究確相對薄弱，因此，對云南有色米種質(zhì)這一寶貴資源的開發(fā)與利用，對中國功能稻米育種發(fā)展將起到積極的推動作用，同時(shí)也將有效促進(jìn)云南地方特色健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國外學(xué)者對紅米種皮顏色基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因位點(diǎn)位于第7染色體，隱性白米種皮無著色是源于Rc基因第6外顯子的14 bp的缺失區(qū)段，缺失導(dǎo)致該基因失去功能[9]。國內(nèi)學(xué)者通過對長雄野生稻、紅寶石及紅米品種培雜191的種皮顏色基因定位也得到相似的結(jié)論，初步定位結(jié)果均顯示種皮顏色基因位于第7染色體上，紅白米之間Rc基因存在類似的缺失變異[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以來自云南省23個(gè)州、縣的35份地方水稻種質(zhì)資源為研究對象，利用分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性分析；同時(shí)探究已報(bào)道的Rc基因在上述35份種質(zhì)材料中的遺傳變異。【擬解決的關(guān)鍵問題】作為云南地方稻種資源的代表，有色米有著重要的社會及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對云南地區(qū)有色米的遺傳多樣性分析及相關(guān)功能基因的鑒定，將實(shí)現(xiàn)有色米在分子水平上的分類，有效解決有色米資源鑒定的精度及準(zhǔn)確度問題，對有色米資源的保護(hù)及利用提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所功能食品作物課題組，收集并篩選出來自23個(gè)州、縣具有代表性的云南地方種質(zhì)資源35份，其中包括23份紅米地方種質(zhì)資源和2份黑米種質(zhì)資源(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 田間取幼嫩葉片，CTAB小樣法提取基因組總DNA，紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量及濃度，稀釋到50 ng/μl備用。

1.2.2 PCR體系 引物：本實(shí)驗(yàn)所選用的的24對水稻SSR引物均勻分布于12條染色體上，來自于http://www.gramene.org，由昆明碩擎有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μl：2×TsingKe Master Mix 5 μl，50 ng/μl DNA模板1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，最后以2.5 μl ddH2O補(bǔ)平。2×TsingKe Master Mix 購買自昆明碩擎有限公司。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64～55 ℃(touch-down PCR)退火30 s，72 ℃下延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后置于白熾燈箱上照相、記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)每個(gè)SSR標(biāo)記在參試各品種相同遷移率位置上(以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn))顯示條帶的有無記錄，有帶記為1，無帶賦值0，建立1，0型二元矩陣。計(jì)算材料間遺傳相似系數(shù)(GS)參照Nei和Li的方法[13]，公式：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni為材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)目，Nj為材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)目，Nij為材料i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù)目。利用GS值按不加權(quán)成對群算術(shù)平均法(UPGMA)和SHAN程序進(jìn)行遺傳相似性聚類分析。利用NTSYS-pc2.1[14]軟件生成樹狀聚類圖。

表1 各品種名稱及米色性狀調(diào)查

續(xù)表1 Continued table 1

編號Number品種名稱Variety name原產(chǎn)地Origin秈/粳Indica/Japonica 米色Rice color15五里香廣南縣粳紅米16黃殼糯保山市粳白米17旱揚(yáng)谷羅平縣粳白米18小硬糯新平縣粳黑米19烏嘴谷鳳慶縣粳白米20長毛背子谷墨江縣粳紅米21西洋谷富寧縣粳紅米22大花糯墨江縣粳紅米23灰谷騰沖市粳紅米24紅吊糯石屏縣秈黑米25毫毫孟連縣秈紅米26老鼠牙江川縣秈紅米27灰皮紫糯版納州秈紅米28冷水谷墨江縣秈紅米29南高谷臨滄市秈紅米30小白糯云 縣秈紅米31大墨谷墨江縣秈紅米32冷水香屏邊縣秈紅米33馬田谷大關(guān)縣秈紅米34細(xì)白谷臨滄市秈紅米35紅米寒窩電景洪市秈紅米

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性

24對SSR引物均能得到清晰且重復(fù)性好的條帶，在35份親本材料中共檢測到78個(gè)等位變異，其中單個(gè)引物可擴(kuò)增出1～6個(gè)等位變異，平均每個(gè)引物可檢測到2.2個(gè)等位變異。引物RM3513和RM6356均能檢測到6個(gè)等位變異(表2)。

表2 SSR標(biāo)記信息

圖1 云南地方有色米種質(zhì)資源多樣性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of diversity of local colored rice germplasm in Yunnan province

2.2 遺傳相似系數(shù)(GS)與聚類分析結(jié)果

根據(jù)SSR標(biāo)記計(jì)算親本間遺傳相似系數(shù)，其變幅為0.59～0.97，平均值為0.78，結(jié)果如圖1所見。來自新平縣的地方有色米種質(zhì)資源小硬糯與來自鳳慶縣的白米地方種質(zhì)資源烏嘴谷遺傳相似系數(shù)最高，為0.97，表明二者親緣關(guān)系最近；其次為孟連縣的紅米種質(zhì)毫毫與新平縣的白米種質(zhì)小矮腳糯(0.9348)。在35份地方種質(zhì)中新平縣的小矮腳糯與耿馬縣的木邦谷間的遺傳相似系數(shù)最低，為0.57，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而同為新平縣的地方種質(zhì)小矮腳糯與小硬糯并未表現(xiàn)出較高的遺傳相似性，遺傳相似系數(shù)僅為0.84。在GS值為0.59處，35份材料可分為2大類，基本上是以粳稻和秈稻為主要區(qū)分歸類標(biāo)準(zhǔn)。在GS值為0.69處，第一亞類又可以分為2組，第1組有14份材料，第2組有2份材料；第二亞類在此處也可以分為2組，第1組有22份材料，第2組有1份材料。從兩大亞類所包含的材料遺傳多樣性來看，粳稻組所包含的材料遺傳相似系數(shù)主要集中在0.78～0.88，而秈稻組材料間遺傳相似系數(shù)主要集中在0.88～0.97，這表明在云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻更豐富。總體來看云南地方種質(zhì)資源中，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區(qū)特有的復(fù)雜地理及氣候條件有較大關(guān)系。

2.3 Rc基因在25份有色米材料中的遺傳變異

利用已報(bào)道的水稻紅米種皮顏色基因Rc序列，針對第6外顯子內(nèi)的14 bp的缺失差異區(qū)段設(shè)計(jì)功能特異引物：GXL：5’-TGAAGGAAGTGATGACAACAAGACC-3’，GXR5’-ATGGTTGGCACTGAAATCACCTTGG-3’，對25份有色米資源進(jìn)行標(biāo)記檢測,結(jié)果表明， 35份云南地方水稻資源中，紅米Rc基因表現(xiàn)為野生型，白米Rc基因表現(xiàn)為突變型，且突變類型與已報(bào)道的突變位點(diǎn)一致，均表現(xiàn)為第6外顯子內(nèi)的14 bp的缺失，這與前人報(bào)道結(jié)果相似。同時(shí)2份黑米材料Rc基因也發(fā)生了類似的缺失突變(圖2)，這與梁婷婷[15]的報(bào)道類似，再次說明黑米和紅米呈色物質(zhì)應(yīng)由不同的代謝途徑產(chǎn)生。

3 討 論

3.1 云南地方有色稻米的遺傳多樣性

水稻是世界一半人口的主要糧食，種植歷史悠久，稻種資源極為豐富。隨著人們生活水平的提高，功能型水稻也越來越受到重視[16]，其中有色米作為代表之一，在中國地方水稻資源中有著多樣類型及廣泛分布。就種皮的顏色而言，可分為紫黑米、紅米、黃米和綠米，其中以紫黑米和紅米最常見。有色米主要分布在云貴高原和華南一帶，其中以云南、廣西、湖南、貴州省居多[17-18]。云南地方稻種資源中有色米資源十分豐富，幾乎占云南地方稻種資源的一半，其中51.23 %是秈稻，48.77 %的是粳稻，集中分布在滇南單、雙季秈稻區(qū)域[19-20]。通過對35份云南地方種質(zhì)(其中25份為有色米資源)的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，基本上是以粳稻和秈稻為主要劃分標(biāo)準(zhǔn)。從兩大亞類所包含的材料遺傳多樣性來看，粳稻組材料遺傳相似系數(shù)主要集中在0.78～0.88，而秈稻組材料間遺傳相似系數(shù)主要集中在0.88～0.97，這表明云南地方品種粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富。總體來看云南地方種質(zhì)資源，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區(qū)特有的復(fù)雜地理及氣候條件有較大關(guān)系。

圖2 紅米白米及黑米的Rc基因第六外顯子的序列差異Fig.2 Sequence differences in the sixth exon of Rc in red rice, white rice and black rice

3.2 水稻紅米Rc基因在云南地方水稻種質(zhì)資源中的遺傳變異

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，對有色稻米的研究轉(zhuǎn)入更深層次的分子水平，即有色米種皮顏色基因的定位與克隆。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)紅米種皮顏色基因位點(diǎn)位于第7染色體，隱性白米種皮無著色是源于Rc基因第6外顯子內(nèi)的14 bp缺失，缺失導(dǎo)致框架改變而使該基因失去功能[9]。國內(nèi)學(xué)者通過對長雄野生稻、紅寶石及紅米品種培雜191的種皮顏色基因定位也得到相似的結(jié)論，初步定位種皮顏色基因位于第7染色體上，紅白米之間Rc基因存在類似的缺失變異[10-12]。對35份云南地方水稻資源中Rc基因變異檢測結(jié)果表明，紅米Rc基因表現(xiàn)為野生型，白米Rc基因表現(xiàn)為突變型，且突變類型與已報(bào)道的突變位點(diǎn)一致，均表現(xiàn)為第6外顯子內(nèi)的14 bp缺失。同時(shí)2份黑米材料Rc基因也發(fā)生了類似的缺失突變，這與梁婷婷[15]結(jié)果一致。通過對不同來源的白米、紅米及紫黑米品種Ra及Rc位點(diǎn)的基因型鑒定。紅米品種為raraRcRc型，黑米品種為RaRarcrc型，而白米品種則為rararcrc型。這說明不同顏色的有色米，花青素物質(zhì)的積累可能通過調(diào)控不同的結(jié)構(gòu)基因來實(shí)現(xiàn)。由于分子標(biāo)記輔助選育已在水稻育種中廣泛應(yīng)用[21]，以上Rc基因的變異信息將為云南有色米的分子標(biāo)記育種提供依據(jù)，

4 結(jié) 論

在云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富。總體來看云南地方種質(zhì)資源，同一來源地的地方品種遺傳差異較大，究其原因與云南地區(qū)特有的復(fù)雜地理及氣候條件有較大關(guān)系。35份云南地方水稻資源中，紅米Rc基因表現(xiàn)為野生型，白米rc基因表現(xiàn)為突變型，且突變類型與已報(bào)道的突變位點(diǎn)一致，均表現(xiàn)為第6外顯子內(nèi)的14 bp的缺失。云南地方品種中粳稻間的遺傳多樣性較秈稻地方種更豐富?？傮w來看，云南地方種質(zhì)資源中同一來源地的地方品種遺傳差異較大。