代景瑩，鄒孟穎，楊 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黃曉兵，王曉冬△

(1.電子科技大學(xué)附屬四川省人民醫(yī)院血液科，成都 611731；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院血液科，成都 610072；3.中國(guó)科學(xué)院四川轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究醫(yī)院，成都 610072)

慢性髓細(xì)胞白血病(CML)以出現(xiàn)Ph染色體而形成BCR-ABL融合基因?yàn)樘卣鱗1]，在酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)時(shí)代，CML的療效得到了革命性的改善[2]，而更新的TKI還表現(xiàn)出除抗腫瘤作用之外的顯著免疫調(diào)節(jié)功效，如第二代TKI達(dá)沙替尼[3-4]。有部分CML患者當(dāng)前可進(jìn)入無(wú)治療觀察階段[5]。但目前仍有部分患者不可避免地發(fā)生疾病進(jìn)展[6]，且目前對(duì)于首選TKI、換藥指征、停藥決策等問(wèn)題尚無(wú)明確統(tǒng)一定論，筆者認(rèn)為可從免疫狀態(tài)評(píng)估的角度對(duì)CML患者的上述問(wèn)題進(jìn)行指導(dǎo)，通過(guò)免疫指標(biāo)的特點(diǎn)與臨床療效之間的相關(guān)性研究，可評(píng)估患者為處于優(yōu)勢(shì)或劣勢(shì)免疫狀態(tài)，從而協(xié)助指導(dǎo)是否應(yīng)更早更換為兼具抗BCR-ABL及免疫調(diào)節(jié)功效的藥物以更好地改善療效，亦可協(xié)助患者的療效預(yù)測(cè)、預(yù)后評(píng)估，甚至在患者的停藥策略等問(wèn)題上起到一定指導(dǎo)意義。而目前認(rèn)為抗腫瘤免疫主要由細(xì)胞免疫應(yīng)答模式介導(dǎo)，其中輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)及效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著最為重要的作用[7-9]。由此，筆者對(duì)CML患者的Th1及CD8+T水平進(jìn)行了檢測(cè)，并將其與臨床療效的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2018年2-12月于四川省人民醫(yī)院血液科就診，并確診為CML的患者。納入的所有患者均通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查確診，符合國(guó)內(nèi)統(tǒng)一的診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究檢測(cè)、分析了納入患者的外周血Th1及CD8+T淋巴細(xì)胞水平，并均按照患者進(jìn)行采血檢測(cè)當(dāng)日的狀態(tài)，對(duì)患者進(jìn)行臨床緩解狀態(tài)的評(píng)估。其中，初診組、細(xì)胞遺傳學(xué)完全緩解(CCyR)組及分子學(xué)緩解4.5(MR4.5)組患者的比較中：初診組10例，男7例，女3例，中位年齡32.5歲(19.0～74.0歲)；CCyR組13例，男10例，女3例，中位年齡64.0歲(25.0～70.0歲)；MR4.5組67例，男39例，女28例，中位年齡46.0歲(17.0～78.0歲)。Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組、Th1低CD8+T高組患者的比較中(Th1高與CD8+T高指Th1比例值與CD8+T比例值高于正常范圍上限，CD8+T非高指CD8+T比例值為正常范圍內(nèi)或低于正常范圍下限，Th1低指Th1比例值低于正常下限)：Th1高CD8+T高組15例，男8例，女7例，中位年齡49.0歲(17.0～78.0歲)；Th1高CD8+T非高組17例，男10例，女7例，中位年齡48歲(17.0～84.0歲)；Th1低CD8+T高組10例，男8例，女2例，中位年齡34歲(26.0～61.0歲)。本研究為回顧性研究，符合與人相關(guān)研究倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 采集患者外周血并通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)其T淋巴細(xì)胞亞群CD8+T淋巴細(xì)胞比例(CD8+T/Lymphocyte)與Th1細(xì)胞比例(Th1/CD4+T)。CD8+T淋巴細(xì)胞比例引用四川省人民醫(yī)院流式細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告中的正常參考范圍(17.6%～30.4%)，Th1細(xì)胞比例(Th1/CD4+T)引用海斯特檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的正常參考范圍(11.8%～25.8%)。采用BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，所需的免疫熒光抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司。(1)Th1細(xì)胞比例的檢測(cè)：全血+RPMI1640培養(yǎng)基混勻，然后加入刺激劑[包括布雷非德菌素A、佛波醇酯(PMA)、離子霉素]在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育4 h，取出并加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記的抗體(抗CD3抗體、抗CD8抗體)，混勻之后于室溫孵育20 min。再加入10×紅細(xì)胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震蕩，室溫10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后，加入相應(yīng)的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，其后加入干擾素-γ(IFN-γ)抗體，孵育20 min，其后PBS洗1遍，加入適量PBS重懸待上機(jī)檢測(cè)。Th1細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3+CD4+，而當(dāng)用PMA刺激4 h時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞明顯減少，甚至消失，這是因?yàn)镻MA會(huì)誘發(fā)細(xì)胞表面CD4分子被內(nèi)吞。所以本研究用CD3和CD8反設(shè)CD4細(xì)胞，即CD3+CD8-細(xì)胞被認(rèn)為是CD3+CD4+細(xì)胞。(2)CD8+T/Lymphocyte的檢測(cè)：紅細(xì)胞裂解液裂紅處理15～20 min，離心，加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記的抗CD45抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體避光4 ℃孵育20 min，PBS洗后離心，重懸于適量PBS中待上機(jī)檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析采用Diva流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行。

1.2.2療效評(píng)估 治療反應(yīng)定義與療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)[10]：CCyR定義為Ph+細(xì)胞為0；主要分子學(xué)緩解(MMR)定義為BCR-ABLIS≤0.1%；MR4.5定義為BCR-ABLIS≤0.003 2%?；诒狙芯炕颊呃龜?shù)較少，并考慮到分析、比較仍具有價(jià)值及指導(dǎo)意義，本研究中未緩解指未達(dá)到CCyR的患者，包括血液學(xué)緩解但未達(dá)到CCyR的患者及未達(dá)到血液學(xué)緩解的患者。

2 結(jié) 果

2.1初診組、CCyR組及MR4.5組患者Th1/CD4+T分析 本研究分析了CML患者初診未治療時(shí)(n=10)、治療后獲得CCyR時(shí)(n=13)及治療后獲得MR4.5時(shí)(n=67)的Th1水平(Th1/CD4+T)，發(fā)現(xiàn)70.00%的初診組患者Th1/CD4+T低于正常范圍下限(Th1/CD4+T引用海斯特檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的正常參考范圍11.8%～25.8%),CCyR組、MR4.5組分別只有15.38%、15.15%的患者Th1/CD4+T低于正常下限。初診組的Th1降低率高于CCyR組及MR4.5組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01、0.00)，見(jiàn)圖1。另一方面，初診組患者Th1/CD4+T值(9.98±7.68)%低于CCyR組(21.27±10.77)%及MR4.5組(21.16±10.17)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01、0.00)，見(jiàn)圖2。

圖1 初診組、CCyR組及MR4.5組Th1/CD4+T低于正常范圍下限的患者百分比比較

2.2Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組臨床緩解狀態(tài)比較 Th1水平可促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化與增殖、進(jìn)一步發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)，而由于在臨床中觀察發(fā)現(xiàn)Th1及CD8+T水平均高于正常上限的患者具有更優(yōu)的緩解狀態(tài)，本研究進(jìn)一步比較Th1高CD8+T高組患者(n=15)與Th1高CD8+T非高組患者(n=16)臨床緩解狀態(tài)(CD8+T/Lymphocyte值參考醫(yī)院流式細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告中正常參考范圍17.6%～30.4%)，結(jié)果顯示86.67%的Th1高CD8+T高組患者及52.94%的Th1高CD8+T非高組患者達(dá)到MR4.5，兩組MR4.5率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)；而13.33%的Th1高CD8+T高組患者及17.65%的Th1高CD8+T非高組患者為未緩解，兩組的未緩解率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.74)，見(jiàn)圖3。

圖2 初診組、CCyR組及MR4.5組患者Th1/CD4+T比較

A：Th1高CD8+T高組；B：Th1高CD8+T非高組

圖3 Th1高CD8+T高組與Th1高CD8+T非高組臨床緩解狀態(tài)比較

A：Th1高CD8+T高組；B：Th1低CD8+T高組

圖4 Th1高CD8+T高組與Th1低CD8+T高組臨床緩解狀態(tài)比較

2.3Th1高CD8+T高組與Th1低CD8+T高組臨床緩解狀態(tài)比較 臨床中觀察發(fā)現(xiàn)Th1/CD4+T值低于正常下限，且CD8+T比例值高于正常上限的患者更多地表現(xiàn)出不良的臨床療效與緩解狀態(tài)，由此本研究進(jìn)一步比較Th1高CD8+T高組患者(n=15)與Th1低CD8+T高組患者(n=10)臨床緩解狀態(tài)，結(jié)果顯示：86.67%的Th1高CD8+T高組患者及20.00%的Th1低CD8+T高組患者達(dá)到MR4.5，兩組MR4.5率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)；而13.33%的Th1高CD8+T高組患者及80.00%的Th1低CD8+T高組患者為未緩解，兩組未緩解率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，見(jiàn)圖4。

3 討 論

隨著對(duì)腫瘤免疫的認(rèn)識(shí)不斷深入，對(duì)腫瘤患者的免疫狀態(tài)評(píng)估及免疫分層在臨床治療方案選擇、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估等方面有著重要指導(dǎo)意義[11-12]，而以提高患者自身抗腫瘤免疫力為目標(biāo)的各種免疫治療策略亦得到了快速及有效的發(fā)展[13-15]。目前認(rèn)為體內(nèi)抗腫瘤主要由細(xì)胞免疫應(yīng)答模式介導(dǎo)，而其中Th1為主導(dǎo)體內(nèi)向細(xì)胞免疫應(yīng)答模式轉(zhuǎn)化的重要輔助性T淋巴細(xì)胞亞群，它分泌IFN-γ、白細(xì)胞介素-2(IL-2)等Ⅰ型免疫應(yīng)答細(xì)胞因子而提供給CD8+T淋巴細(xì)胞徹底活化的第3信號(hào)，從而促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化與增殖，CD8+T淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免疫應(yīng)答中的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步執(zhí)行最終識(shí)別及有效清除癌細(xì)胞的任務(wù)[7-9]。筆者前期研究亦發(fā)現(xiàn)，Th1水平的升高與臨床療效呈正相關(guān)[16]。由此，Th1及CD8+T淋巴細(xì)胞為抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著最為關(guān)鍵作用的兩個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群?；诖耍P者認(rèn)為對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞及Th1水平的監(jiān)測(cè)對(duì)于腫瘤患者的抗腫瘤免疫力評(píng)估、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估等可能具有一定的指導(dǎo)意義，且Th1及CD8+T淋巴細(xì)胞水平的檢測(cè)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)現(xiàn)具有檢測(cè)方法較簡(jiǎn)單、成本低、作為臨床長(zhǎng)期免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)可行性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。由此，筆者所在課題組對(duì)長(zhǎng)期診療、隨訪的CML患者進(jìn)行了Th1水平(Th1/CD4+T)及CD8+T水平(CD8+T/Lymphocyte)的檢測(cè)與分析。

研究結(jié)果顯示，Th1高CD8+T高的患者表現(xiàn)出較Th1高CD8+T非高的患者更高的MR4.5率(P=0.03)，提示Th1及CD8+T雙高的患者具有更深的緩解度。另一方面，本研究將Th1高CD8+T高的患者與Th1低CD8+T高的患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者的MR4.5率明顯高于后者(P=0.00)，而前者的未緩解率卻明顯低于后者(P=0.00)，提示Th1高CD8+T高的患者具有更高的緩解率與更深的緩解度。本研究上述結(jié)果均提示，Th1高CD8+T高的患者有更大的概率獲得更好的療效及更優(yōu)的預(yù)后。

除此之外，本研究還對(duì)初診未治療時(shí)CML患者的Th1水平進(jìn)行了分析，并與治療后達(dá)到CCyR或MR4.5的患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)治療后獲得CCyR或MR4.5的患者Th1/CD4+T值均較初診患者高(P=0.01、0.00)；另一方面，初診未治療患者Th1/CD4+T值低于正常下限的患者比例增多，70.00%的初診組患者Th1/CD4+T值低于正常下限，而僅有15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者其Th1/CD4+T值低于正常下限，提示初診未治療患者的Th1水平顯著低下。筆者推論治療后患者若發(fā)生良好的治療反應(yīng)并逐漸獲得更深的緩解深度，其自身機(jī)體免疫力將得到相應(yīng)的恢復(fù)與提升，從而具備更強(qiáng)的自身抗腫瘤免疫力，利于進(jìn)一步有效清除體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，這一假設(shè)推論與本研究觀察得到的結(jié)果一致，即在治療后獲得良好的緩解情況伴隨著Th1水平的顯著提升。由此，Th1水平的監(jiān)測(cè)對(duì)于患者的療效預(yù)測(cè)與預(yù)后評(píng)估可起到一定指導(dǎo)意義。

值得注意的是，筆者所在課題組前期研究亦已分析了不同TKI治療后患者的免疫指標(biāo)特點(diǎn)，結(jié)果顯示達(dá)沙替尼組患者的Th1水平明顯高于尼洛替尼組及伊馬替尼組，顯示出達(dá)沙替尼特有的免疫調(diào)節(jié)作用[16]。但筆者所在課題組進(jìn)一步分析，達(dá)沙替尼組、尼洛替尼組及伊馬替尼組中各自分別均有緩解良好及緩解不理想的患者，而3組中緩解不理想的患者均常常伴隨著不理想的免疫指標(biāo)狀況，由此，本文旨在單從免疫學(xué)的角度進(jìn)行分析(而并不考慮患者使用何種TKI治療的因素)，以探索免疫指標(biāo)Th1及CD8+T淋巴細(xì)胞與療效的相關(guān)性，以期在CML臨床診療中起到一定的指導(dǎo)意義，并在本研究中證實(shí)了免疫指標(biāo)Th1及CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)療效預(yù)測(cè)具有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，初診未治療CML患者表現(xiàn)出低下的Th1水平，而治療后Th1水平的提升預(yù)示更好的治療反應(yīng)；治療后Th1及CD8+T雙高提示更高的臨床緩解率及更深的緩解度，而Th1低CD8+T高提示不理想的臨床狀態(tài)。因此，Th1水平及CD8+T淋巴細(xì)胞水平可作為臨床對(duì)CML患者的長(zhǎng)期規(guī)律免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)，以助于評(píng)估患者免疫狀態(tài)，并對(duì)CML患者的臨床療效預(yù)測(cè)起到一定的指導(dǎo)作用。