梁育飛，鄭國啟△，李春英，孫寧寧，郭忠建

(滄州市中心醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.病理科，河北滄州 061001)

惡性腹膜間皮瘤(malignant peritoneal mesothelioma，MPeM)是發(fā)生于腹膜間皮組織的惡性腫瘤，發(fā)病率低，易被漏診或誤診[1]。該病以40～70歲多見，男女比例約2∶1，臨床表現(xiàn)缺乏特異性。組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色在間皮瘤的診斷中占有重要地位[2]，該病病死率高，預(yù)后差。因此，尋找預(yù)后影響因素已成為目前研究的熱點(diǎn)。Ki67、微型染色體維持蛋白2(minichromosome maintenance protein 2，MCM2)、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子-1(excision repair cross complementing group 1,ERCC1)、FLI-1、血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascularendothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3)、程序性死亡受體-配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)和絨毛蛋白Villin通過促進(jìn)細(xì)胞分化增殖及抑制細(xì)胞凋亡等不同途徑在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測以上7種標(biāo)記物在MPeM組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，探討這些標(biāo)記物與臨床病理因素對預(yù)后判斷的價值，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號：2012-012-01)，收集2013年1月至2016年12月在本院經(jīng)B型超聲引導(dǎo)下穿刺活檢或手術(shù)獲取的14例患者非上皮型MPeM組織石蠟標(biāo)本，并收集同期30例患者上皮型MPeM組織石蠟標(biāo)本。所有患者均為初診病例并且資料完整。標(biāo)本切片均經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師閱片后確診，MPeM病理診斷符合2012年美國《間皮瘤病理學(xué)診斷指南》[2]?；颊吣挲g42～84歲，平均(62.86±10.89)歲，男15例、女29例。臨床TNM分期[3]：Ⅰ期，腫瘤局限于腹膜；Ⅱ期，腫瘤侵犯腹腔內(nèi)淋巴結(jié)；Ⅲ期，腫瘤向腹腔外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅳ期，遠(yuǎn)處血行轉(zhuǎn)移。Ⅰ+Ⅱ期患者34例，Ⅲ+Ⅳ期患者10例。

1.2主要試劑 鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號：MIB-1)，兔抗人微小染色體維持蛋白2克隆抗體(克隆號：EP-40)，鼠抗人ERCC1單克隆抗體(克隆號：UMAB8)，鼠抗人FLI-1單克隆抗體(克隆號：MRQ-1)，鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子受體-3單克隆抗體(克隆號：KLT9)，鼠抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號：UMAB-228)，鼠抗人Villin單克隆抗體(克隆號：OTI3B3)，均購自中國北京中杉生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 全部腹膜組織標(biāo)本在同一條件下采用免疫組織化學(xué)染色SP法。經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，加入一抗，經(jīng)孵育過夜后，滴加生物素標(biāo)記二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素對比復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、中性樹膠封片。每張切片隨機(jī)取3個高倍視野，以陽性細(xì)胞比例的平均值定義為該腫瘤的陽性細(xì)胞百分比。Ki67陽性細(xì)胞多數(shù)為核著色，呈棕黃色，少數(shù)為較弱的細(xì)胞質(zhì)染色；MCM2、ERCC1和FLI-1陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色到深褐色顆粒；VEGFR-3陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色至棕褐色顆粒；PD-L1和Villin均以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色至棕褐色為陽性。陽性染色細(xì)胞百分比小于5%，判為“-”；5%～<26%判為“+”；26%～50%判為“++”，>50%判為“+++”。

1.3.2隨訪 生存期以病理診斷證實為MPeM的日期為起點(diǎn)，隨訪至2017年6月，以月為單位，至隨訪終點(diǎn)仍生存作為截尾值處理。全組無失訪病例。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法。相關(guān)性分析采用Spearman等級分析。單因素生存分析比較采用Kaplan-Meier法，時序檢驗(Log-rank法)比較其差異，多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)記物在MPeM組織中的表達(dá) 在44例MPeM中，MCM2陽性率最高，為100.0%；其次為FLI-1，陽性表達(dá)者42例，陽性率為95.4%；ERCC1陽性表達(dá)者31例，陽性率為70.4%；Ki67陽性表達(dá)者21例，陽性率為47.7%；VEGFR-3、Villin、PD-L1的陽性率分別為18.2%、15.9%、6.8%。見圖1。

表1 MPeM各標(biāo)記物與臨床病理學(xué)的關(guān)系(n)

續(xù)表1 MPeM各標(biāo)記物與臨床病理學(xué)的關(guān)系(n)

A:Ki67；B:ERCC1；C:FLI-1；D:MCM2；E:VEGFR-3；F:PD-L1；G:Villin

圖1 7種標(biāo)記物在MPeM的表達(dá)(SP，×400)

2.2標(biāo)記物與臨床病理學(xué)的關(guān)系 44例MPeM中，6項標(biāo)記物(Ki67、ERCC1、FLI-1、VEGFR-3、PD-L1和Villin)與臨床病理因素的關(guān)系見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析，各指標(biāo)組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各標(biāo)記物表達(dá)間的相關(guān)性 在44例MPeM中，F(xiàn)LI-1和ERCC1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.337，P=0.025)；FLI-1和PD-L1(r=-0.374，P=0.012)、ERCC1和PD-L1(r=-0.418，P=0.005)的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。其余標(biāo)記物相互間均無相關(guān)性。

2.4影響MPeM患者預(yù)后的單因素及多因素分析 本組44例患者隨訪資料完整，無失訪病例。最后隨訪時間為2017年6月。隨訪期間，40例患者死于疾病復(fù)發(fā)。1年總生存率為19.9%，2年總生存率為4.4%，中位生存時間為7個月，見圖2。將患者性別、年齡(60歲)、石棉、血小板、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、胸膜斑、組織學(xué)類型、化療及7項標(biāo)記物進(jìn)行單因素分析，顯示化療(P=0.027)、TNM分期(P=0.006)、ERCC1(P=0.027)及Ki67標(biāo)記指數(shù)大于或等于20%(P=0.030)是與預(yù)后有關(guān)的因素，而其余指標(biāo)均與預(yù)后無關(guān)(P>0.05)。見圖3、表2。

圖2 44例MPeM患者的總生存曲線

2.5影響MPeM患者預(yù)后的多因素分析 將單因素分析有意義的4項指標(biāo)納入COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期(P=0.031)及Ki67標(biāo)記指數(shù)大于或等于20%(P=0.036)是影響MPeM預(yù)后的獨(dú)立危險因素，見表3。

表2 MPeM預(yù)后相關(guān)因素的單因素分析

A：ERCC1與MPeM生存時間的關(guān)系；Ki67與MPeM生存時間的關(guān)系；TNM分期與MPeM生存時間的關(guān)系；化療與MPeM生存時間的關(guān)系

圖3 ERCC1、Ki67、TNM分期、化療與MPeM生存時間的關(guān)系

表3 MPeM預(yù)后相關(guān)因素的多因素分析

3 討 論

MPeM是一種腹膜少見疾病，臨床缺乏特異性，確診需靠腹膜活組織病理學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)染色對于診斷具有重要意義。針對其機(jī)制及預(yù)后的研究已成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)，不同學(xué)者對于MPeM預(yù)后的因素分析有不同結(jié)論。YAN等[4]報道，組織分型、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)及腹腔內(nèi)熱灌注化療(HIPEC)是獨(dú)立的預(yù)后影響因素。DAMHUIS等[5]報道，年齡及性別是獨(dú)立的預(yù)后影響因素。免疫組織化學(xué)指標(biāo)對預(yù)后的影響如何，文獻(xiàn)較少報道。因此，本研究聯(lián)合臨床病理學(xué)指標(biāo)及Ki67、ERCC1、Fli-1等免疫組織化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行預(yù)后分析，以期得出影響MPeM預(yù)后的危險因素。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素、多階段和多基因改變的復(fù)雜過程，有多重因子參與其中。Ki67抗原是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，是檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一，與多種腫瘤的預(yù)后有關(guān)[6-7]。Ki-67在MPeM組織中表達(dá)的報道較少，主要與MPeM相對少見有關(guān)。PILLAI等[8]研究了42例MPeM腫瘤中Ki67的表達(dá)，結(jié)果提示Ki67抗原的高表達(dá)與不良生存相關(guān)。本研究中，Ki67陽性表達(dá)率為47.7%，單因素和多因素檢測Ki67標(biāo)記指數(shù)大于或等于20%與預(yù)后有關(guān)，且是預(yù)后的獨(dú)立危險因素。這提示腫瘤分化越差，增殖活性越強(qiáng)，惡性程度越高。根據(jù)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所制訂的TNM分期能夠較好地反映腫瘤的發(fā)展程度，同時對于預(yù)后有一定參考價值[9]。本研究中，Ⅰ+Ⅱ期患者生存期明顯較Ⅲ+Ⅳ期患者長，也是預(yù)后的獨(dú)立危險因素，提示腫瘤分期越早，治療越早，對于疾病轉(zhuǎn)歸越有利。

ERCC1不僅是核苷酸切除修復(fù)(NER)活性的標(biāo)志性基因，也是細(xì)胞存活必需的DNA修復(fù)基因。在腫瘤組織中，ERCC1通過對放射線或者化療藥物的DNA損傷修復(fù)導(dǎo)致治療失敗。目前研究較多的是胃癌、大腸癌[10]、肺癌等。MATSUBARA等[11]認(rèn)為，ERCC1是進(jìn)展期胃癌預(yù)后評估的有效指標(biāo)。另有研究報道，ERCC1陰性表達(dá)的患者有很好的化療反應(yīng)性，是評價患者預(yù)后的一個重要因子[12]。本研究結(jié)果顯示，ERCC1的陽性表達(dá)率達(dá)70.4%，生存分析顯示ERCC1與預(yù)后有關(guān)，但并不是獨(dú)立危險因素，提示ERCC1表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，患者生存時間越短，與上述研究相符。FLI-1基因是人類ETS基因家族中的一員，參與DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。MHAWECH-FAUCEGLIA等[13]發(fā)現(xiàn)，尤文肉瘤/原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤(EWS/PNET)、嗅神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、橫紋肌肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、良惡性血管瘤、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌組織中均可檢測到不同程度的FLI-1表達(dá)。KAYGUSUZ等[14]對52例患者胃腸道間質(zhì)瘤組織進(jìn)行檢測，卻未發(fā)現(xiàn)FLI-1表達(dá)，提示其不參與胃腸道間質(zhì)瘤的形成。本研究中，F(xiàn)LI-1的陽性表達(dá)率高達(dá)95.4%，提示腹膜間皮瘤與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制存在明顯差別，可以用來作為診斷腹膜間皮瘤的參考指標(biāo)。

MCM2只存在于細(xì)胞周期的細(xì)胞核中，在增殖細(xì)胞中表達(dá)水平高，在靜止期細(xì)胞或分化好的細(xì)胞中不表達(dá)或水平很低，提示MCM2可以作為增殖細(xì)胞的特異標(biāo)志。有研究顯示，在胃癌組織中MCM2的表達(dá)明顯高于正常黏膜組，且MCM2的表達(dá)水平與預(yù)后呈正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，MCM2在MPeM中的表達(dá)率為100.0%，提示MCM2與腹膜間皮瘤病理類型無關(guān)，也提示檢測MCM2對于診斷MPeM具有很高的參考價值。但在生存分析中，MCM2不是影響預(yù)后的因素，這可能與MPeM的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，是否與病例數(shù)相對不足有關(guān)尚不清楚，需進(jìn)一步積累資料證實。

Villin通常只表達(dá)于有刷狀緣的細(xì)胞上，如胃腸道上皮細(xì)胞、胰腺和膽管上皮細(xì)胞等，因此，Villin蛋白在胃腸道癌、胰腺癌和膽管癌中有較高的表達(dá)[16]。VEGFR-3是受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員，是第一個被鑒定的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，它在腫瘤組織血管和淋巴管中均有表達(dá)，血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)可以與VEGFR-3結(jié)合參與淋巴管生成的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。本研究中，Villin的表達(dá)率僅為15.9%，這可以作為鑒別間皮瘤和腺癌的特異抗體之一，而VEGFR-3的陽性率也僅為18.2%，這提示MPeM不是以淋巴轉(zhuǎn)移為主，而是以匍匐浸潤為主要轉(zhuǎn)移方式。

值得注意的是，本研究中，PD-L1的陽性率僅為6.8%。PD-L1可以負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，避免免疫細(xì)胞的殺傷[18]。筆者推測，腹膜間皮瘤屬于惰性腫瘤，轉(zhuǎn)移或浸潤慢，PD-1及其配體PD-L1可能未啟動腫瘤殺傷效應(yīng)，本組中有1例患者口服PD-1抑制劑pembrolizumab，復(fù)查腹膜間皮瘤較前進(jìn)展，提示對于腹膜間皮瘤，不適宜應(yīng)用PD-1抑制劑pembrolizumab治療，并且PD-L1也不適宜用于MPeM的檢測及預(yù)后。

綜上所述，在本組MPeM中，MCM2和FLI-1對于診斷MPeM具有較高的敏感性，VEGFR-3和Villin對于鑒別腺癌和MPeM具有一定價值，Ki67和TNM分期是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素。由于本組病例數(shù)較少，需進(jìn)一步增加樣本量以增進(jìn)準(zhǔn)確性。