徐吉淋，王路喬，梁 倩，楊人強

(1.長江航運總醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430019;2.南昌大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,南昌 330006；3.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，昆明650031;4.南昌大學第二附屬醫(yī)院分子中心,南昌 330006)

血小板的激活和各種血小板因子的釋放是觸發(fā)急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)的始動和核心環(huán)節(jié)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血小板的激活不僅能促進血栓形成，還能激活機體免疫炎性反應(yīng)[1-2]。血小板表面存在Toll樣受體4(TLR4)、CD40L、P-selectin等免疫分子。TLR4的表達在活化和非活化的血小板之間不同,活化的血小板TLR4表達明顯升高[3-4]。TLR4在ACS患者單核細胞中過表達，并且這些過表達的TLR4通過TLR4/核因子(NF)-κB信號通路調(diào)控免疫炎性反應(yīng)[5-6]。近年有研究表明，血小板、巨核細胞中存在大量有功能的NF-κB家族成員，并且它們和血小板免疫炎癥密切相關(guān)，具體機制有待進一步研究[7]。miR-146是第一個被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA,其能誘導(dǎo)巨核細胞增生分化[8]，并且在小鼠成熟巨核細胞中表達增加[9]。在血小板生成過程中，巨核細胞中線粒體、核糖體等細胞器及多種不同細胞因子的pre-mRNA轉(zhuǎn)移到血小板，因此miRNA通過影響巨核細胞中mRNA的合成進一步影響血小板功能[9]。本文研究miR-146a對巨核細胞裂解產(chǎn)生的血小板免疫炎癥功能的影響，為抑制血小板免疫炎癥的治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人慢性粒細胞白血病細胞K562由南昌大學第二附屬醫(yī)院分子中心饋贈；高糖1640培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS，以色列BI公司)； miR-146a mimic、miR-146a inhibitor、mimic-NC、inhibibor-NC、miR-146a/U6的RT-qPCR引物(吉瑪公司)； lipofectmine 2000(全式金公司)； TLR4一抗(美國Proteintech公司)，NF-κB一抗(美國Abcam公司)，β-actin一抗、鼠二抗、兔二抗(中杉金橋公司)；白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒[優(yōu)爾生(uscnk)];RT-PCR、qPCR試劑盒(Tiangen公司);佛波酯(美國Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及巨核細胞模型建立 常規(guī)培養(yǎng)K562細胞，按照前期實驗摸索條件，復(fù)制K562細胞向巨核細胞分化模型，待細胞處于對數(shù)增殖期時，加入佛波酯(DMSO溶解，終濃度為10 ng/mL) 誘導(dǎo)72 h，離心收集誘導(dǎo)后細胞，培養(yǎng)基重懸，接種于新的培養(yǎng)皿中用于后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染實驗。

1.2.2細胞形態(tài)分析 收集誘導(dǎo)前后K562細胞離心涂片，在光鏡下觀察誘導(dǎo)前后細胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測表面標志分子 用流式細胞儀檢測誘導(dǎo)前后K562細胞CD61和CD41陽性血小板百分率。三色流式細胞分析法詳細操作步驟參考文獻[5]。

1.2.4轉(zhuǎn)染佛波酯誘導(dǎo)分化 誘導(dǎo)后細胞增殖至80%左右匯合時進行siRNA轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑操作指南操作，分別導(dǎo)入miR-146a mimic、miR-146a inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC等。

1.2.5熒光定量檢測miR-146a水平 收集細胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA,PCR擴增。miR-146a：上游引物5′-TAATCGTGTGAGAACTGAATTC-3′，下游引物5′-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′；U6：上游引物5′-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCT TCACGAATTTG-3′。具體步驟參照熒光定量試劑盒說明書。擴增條件：95 ℃ 15 min 1個循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s 40個循環(huán)。每個標本均做3個復(fù)孔，結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行相對基因分析。

1.2.6ELISA測定IL-6、TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平，結(jié)果經(jīng)酶標儀讀數(shù)，在標準曲線上進行定量分析。

1.2.7Western blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染3 d后的細胞懸浮液離心(1 000 r/min離心5 min)，PBS洗滌3次；加入50 μL×Loading Buffer漩渦振蕩充分裂解細胞，置沸水中煮10 min，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂牛奶封閉2 h，雙蒸水洗膜5 min×3次，加入稀釋好的一抗4 ℃搖床孵育36～48 h，TBST洗滌10 min×3次。加入二抗常溫孵育1.5 h，TBST 洗滌10 min ×3次。加入顯影液曝光，以β-actin 作為內(nèi)參照。

1.2.8RT-PCR檢測NF-κB、IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)水平 收集細胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA,PCR擴增。具體步驟參照RT-PCR試劑盒說明書。NF-κB、IRAK1引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，循環(huán)30次；總延伸72 ℃ 7 min。IRAK1退火溫度56.8 ℃，NF-κB退火溫度 57.8 ℃。

表1 引物系列

1.2.9靶基因預(yù)測 利用3種常用的靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、PicTar、miRanda)預(yù)測miR-146a可能作用的靶基因，結(jié)合miR-146a在調(diào)控血小板免疫炎癥過程中的作用，在預(yù)測結(jié)果交集中篩選出IRAK1基因為潛在的靶基因；通過熒光素酶報告基因法驗證IRAK1是否含有miR-146a的靶位點；通過檢測過表達或抑制表達miR-146a后細胞中靶基因mRNA及蛋白表達的變化，從而確定miR-146a與靶基因的對應(yīng)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學變化 K562細胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后，隨著時間的延長細胞逐漸變形，到72 h時細胞變化最明顯，呈現(xiàn)出巨核細胞特點：細胞形態(tài)為圓形或橢圓形，邊緣不規(guī)則，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，排列緊密，核仁不甚清晰，出現(xiàn)空泡及偽足等，見圖1。

A:誘導(dǎo)0 h；B誘導(dǎo)24 h；C：誘導(dǎo)48 h；D：誘導(dǎo)72 h

圖1 佛波酯誘導(dǎo)K562細胞的形態(tài)變化(×100)

2.2表面標志物CD41和CD61表達水平 K562細胞表面幾乎不表達CD41和CD61，而佛波酯誘導(dǎo)72 h后，流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD41和CD61的陽性率分別高達38.7%和46.45%，見圖2。

圖2 佛波酯誘導(dǎo)K562細胞前后CD41、CD61表達變化

2.3siRNA轉(zhuǎn)染效率的測定 與mimic-NC組相比，miR-146a mimic組miR-146a的表達明顯升高(約77.5倍)；與inhibitor-NC組相比，miR-146a inhibitor組miR-146a表達下降(約7.5倍),見圖3。

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后各組miR-146a水平變化

2.4miR-146a對IL-6、TNF-α水平的影響 與mimic-NC組相比， miR-146a mimic組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與inhibitor-NC組相比，miR-146a inhibitor組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 各組細胞IL-6、TNF-α水平

a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05 與mimic-NC組比較;c：P<0.05，與inhibitor-NC組比較

2.5miR-146a對TLR4、NF-κB蛋白表達的影響 轉(zhuǎn)染72 h后提取總蛋白質(zhì)行Western blot，結(jié)果顯示miR-146a mimic組中TLR4蛋白表達明顯升高，NF-κB蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA行RT，結(jié)果顯示： miR-146a mimic 可降低NF-κB mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖4 各組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖5 各組細胞NF-κB mRNA表達

2.6驗證靶基因 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染Pmir-Report-WT-IRAK-1-3′UTR載體與miR-146a mimic，在細胞內(nèi)miR-146a與IRAK1 3′UTR相結(jié)合，使得載體熒光素酶不表達，熒光素酶活性受到明顯抑制；而將此共轉(zhuǎn)染體系中更換為mimic-NC或Pmir-Report-MUT-IRAK-1-3′UTR載體，則熒光素酶表達不受影響，熒光強度無明顯變化，見圖6。hsa-miR-146a可以與IRAK1的3′UTR相結(jié)合，IRAK1是hsa-miR-146a的靶基因。進一步的生物學實驗表明hsa-miR-146a過表達能降低IRAK1蛋白表達而不影響IRAK1 mRNA表達，阻遏hsa-miR-146a的表達則提高了IRAK1的蛋白表達，IRAK1 mRNA表達也無明顯變化，見圖7、8。hsa-miR-146a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制IRAK1表達，再次證實IRAK1是hsa-miR-146作用的靶基因。

圖6 雙熒光素酶報告基因交叉轉(zhuǎn)染后對熒光素酶活性的影響

圖7 各組細胞IRAK1 mRNA表達

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖8 各組細胞IRAK1蛋白表達

3 討 論

激活的血小板自身能分泌多種炎癥因子，如IL-1β、IL-3、IL-6、TNF-α[10]。此外，血小板激活后通過與血管內(nèi)皮、循環(huán)中的白細胞相互作用，釋放多種促炎分子[4,11-12]。因此，血小板的免疫炎性反應(yīng)不僅參與動脈粥樣斑塊破裂及血栓形成，還貫穿在動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展的整個慢性炎性反應(yīng)過程中[13-14]。研究血小板的免疫炎性反應(yīng)，對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的預(yù)防和治療有著深遠意義。然而血小板體外存活時間短，保存困難，容易激活，體外研究困難。K562細胞是一種雙分化潛能的人慢性粒細胞白血病細胞，在國際上被通用于研究巨核細胞的分化研究。本實驗成功復(fù)制了體外用佛波酯誘導(dǎo)K562細胞構(gòu)建巨核細胞/血小板模型[15]，通過轉(zhuǎn)染miR-146a siRNA成功上調(diào)或下調(diào)了miR-146a水平。上調(diào)miR-146a表達后，TLR4蛋白明顯升高，NF-κB mRNA和蛋白降低，細胞上清IL-6、TNF-α水平明顯降低。下調(diào)miR-146a表達后，TLR4蛋白明顯降低，NF-κB mRNA和蛋白明顯升高，細胞上清IL-6、TNF-α水平明顯升高。IRAK1是TLR4/NF-κB信號通路中的一關(guān)鍵分子,多個生物信息學軟件都預(yù)測到IRAK1是miR-146a的一個靶基因，通過雙熒光素酶報告基因證明在血小板中miR-146a可以靶向作用于IRAK1，并通過Western blot和RT-PCR檢測證明血小板中miR-146a也能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IRAK1的表達。從而表明miR-146a可通過TLR-4/NF-κB炎癥通路抑制血小板的炎性反應(yīng)，并且其可能機制是通過作用TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵靶點IRAK1，負性調(diào)節(jié)此通路，減弱該通路下游NF-κB介導(dǎo)的IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達。目前研究的miR-146a抗炎的經(jīng)典途徑之一是miR-146a通過靶向作用于IRAK1、TRAF6，負向調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路，抑制該通路下游NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子的表達[16-17]。上述經(jīng)典途徑與本研究結(jié)果完全一致。然而，也有研究表明miR-146a可促進動脈粥樣硬化的炎癥，加重冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[18-19]。因此，需要進一步研究miR-146a在血小板免疫炎癥及冠狀動脈粥樣性心臟病中的的作用機制。