王 楠,高曉霞,張愛榮,王佩義,秦雪梅*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥有限公司;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

定坤丹是由紅參、鹿茸、西紅花、等20余味藥材經(jīng)加工制成的大蜜丸[1]，具有滋補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)舒郁的功效。臨床上常用于痛經(jīng)[2-4]、月經(jīng)不調(diào)[5]、多囊卵巢綜合征[6]、圍絕經(jīng)期綜合征(更年期綜合征)[7]、子宮內(nèi)膜異位癥[8]等婦科疾病。

現(xiàn)行《中國藥典》(2015版,一部)主要針對紅參、三七中人參皂苷類成分進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別與含量測定,并采用顯微鑒別與TLC法對川芎、枸杞子、白芍、白術(shù)、甘草等藥材中特征進(jìn)行控制[1]。但由于定坤丹組方復(fù)雜,藥味眾多,且其中定性鑒別需要多次實驗分別定性不同藥材及對照品,步驟繁多復(fù)雜,而現(xiàn)有含量測定方法控制成分單一,僅限制了其中紅參及三七藥材的質(zhì)量,對于藥味眾多的定坤丹復(fù)方并不能反映其質(zhì)量全貌。而核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)可以全面反映復(fù)雜樣品中化合物的信息,可定性、半定量地用于復(fù)雜成分質(zhì)量評價[9,10]。本研究利用核磁共振氫譜檢測建立定坤丹的指紋圖譜,從整體上綜合反映不同生產(chǎn)批次定坤丹的整體質(zhì)量,為其內(nèi)在質(zhì)量特征評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker 600-MHz AVANCE III NMR Spectrometer(600.13 MHz質(zhì)子頻率,德國布魯克公司600兆核磁儀),超聲清洗儀(KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司),萬分之一天平(CPA225D電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);重水(Norell,Landisville,美國),氘代甲醇、氘代氯仿(CDCl3,99.8%,德國Merck公司),氘代氫氧化鈉(Armar,瑞士),3-三甲基硅基[2,2,3,3-d4]氘代丙酸鈉(TSP,Cambridge Isotope Laboratories Inc.,MA)。

定坤丹(批號:139170643,139170645,139170647,139170649,139170651,139170653,139170655,139170657,139170659,139170662,由山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥集團(tuán)有限公司提供,記做S1-10);超純水由Milli-Q Integral Water Purification System(美國Millipore公司)制備;甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司);其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將定坤丹大蜜丸剪碎,稱取200 mg,加等量硅藻土研磨,置于10 ml玻璃離心管中,分別加蒸餾水及甲醇1.5 ml、氯仿3 ml,渦旋混勻后超聲提取25 min,室溫離心(3 500 r/min)25 min,提取液分為兩層(上層為水溶性部分即甲醇-水相,下層為有機(jī)部分即氯仿相),分別減壓濃縮蒸干。于測定前用氘代試劑溶解,其中氯仿相部分用CDCl3(含0.03%TMS)800 μl溶解,甲醇-水相部分用氘代甲醇400 μl與緩沖重水(KH2PO4溶于D2O中,以1 mol/L氘代氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 6.0,含0.05% TSP)400 μl溶解,渦旋溶解,以13 000 r/min離心10 min,移取上清液600 μl于5 mm核磁管中。

1.2.21H NMR測定 樣品在25 ℃下于600 MHz NMR儀上測定,測定頻率為600.13 MHz,掃描次數(shù)為64,譜寬12 345.679 Hz,傅里葉變換0.188 Hz,脈沖間隔D1為1 s,延遲時間為5.0 s,手動進(jìn)行相位、基線調(diào)節(jié)及峰校正。含水甲醇提取物核磁測定采用noesyppr 1D序列壓制水峰,用氘代甲醇進(jìn)行鎖場,內(nèi)標(biāo)為TSP。氯仿相提取物核磁測定采用zg30序列,用氘代氯仿鎖場,內(nèi)標(biāo)為TMS。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 核磁圖譜采用MestReNova(version 8.0.1,西班牙Mestrelab Research公司)軟件進(jìn)行處理。以化學(xué)位移值(δ)0.01積分段對化學(xué)位移區(qū)間δ 0.5-9.0進(jìn)行分段積分,其中甲醇-水相δ 4.92-4.96(殘余水峰)和δ 3.28-3.32(殘余甲醇峰)不進(jìn)行積分,氯仿相其中δ 7.20-7.32(殘余氯仿峰)不進(jìn)行積分。積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行面積歸一化后,采用SPSS軟件16.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。相關(guān)系數(shù)>0.9,P<0.01,說明結(jié)果呈顯著相關(guān)。此外,參照《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2008版)方法選擇平均數(shù)為指標(biāo)生成對照核磁圖譜(記做Sc)。

2 結(jié)果

2.1 樣品核磁指紋圖譜

10批次定坤丹的甲醇-水相和氯仿相1H NMR指紋圖譜結(jié)果表明,10批次定坤丹出峰穩(wěn)定,沒有明顯差異(見圖1,2)。甲醇-水相NMR圖譜表征的峰主要位于δ 3.10 -5.50,主要為糖類成分的信號,δ 0.50 -3.10主要為有機(jī)酸類成分信號,δ 5.50-9.00主要為芳香化合物的信號;氯仿相NMR圖譜表征峰主要位于δ 0.50-3.10,為低極性的脂肪酸類成分的信號。

2.2 Pearson相關(guān)性分析

將10批復(fù)方的核磁歸一化積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS中進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,得到相關(guān)系數(shù)(見表1,2),結(jié)果表明10批次圖譜間的相關(guān)系數(shù)均大于0.9,且各組間P<0.01,即這10批DKD產(chǎn)品均呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系,質(zhì)量較為均一穩(wěn)定。此外,將參照《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2008版)方法以平均數(shù)為指標(biāo)生成的對照指紋圖譜(記做Sc),與各批次樣品進(jìn)行比較并計算圖譜間相關(guān)系數(shù)(見表1,2),結(jié)果表明10批次DKD樣品與對照核磁圖譜相比較得到的相關(guān)系數(shù)均大于0.95,表明這10批DKD質(zhì)量較為均一穩(wěn)定。

2個小圖是S1批次的局部放大圖圖1 10批次定坤丹甲醇-水相1H NMR指紋圖譜Figure 1 1H NMR fingerprint of DKD’s methanol-aqueous phase

圖2 10批次定坤丹氯仿相1H NMR指紋圖譜Figure 2 1H NMR fingerprint of DKD’s chloroform phase

表1 不同批次定坤丹樣品甲醇-水相Pearson相關(guān)系數(shù)

表2 不同批次定坤丹樣品氯仿相Pearson相關(guān)系數(shù)

3 討論

選擇核磁共振方法建立指紋圖譜的原因:核磁共振氫譜響應(yīng)穩(wěn)定;所有含H的化合物都可以出峰,全面出峰,無偏向性;可以較為完整地表征中藥材的初級和次級代謝物[11]。

在選擇定坤丹備樣條件時,選擇了兩相提取法對定坤丹樣本進(jìn)行提取,甲醇水相和氯仿相共同提取可以更全面地表征復(fù)方的成分。

指紋圖譜相似度計算是一種廣泛用于指紋圖譜數(shù)據(jù)評價的方法[12],國家藥典委員會發(fā)布了相應(yīng)的軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》用于相似度的科學(xué)評價。但由于本研究所得的核磁共振圖譜數(shù)據(jù)格式不適用該軟件,本文作者參照相似度評價系統(tǒng)的計算方法及文獻(xiàn)[13]報道,選擇采用SPSS軟件進(jìn)行了Pearson相關(guān)性的分析,得到的相關(guān)系數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pearson相關(guān)系數(shù)可以作為相似度的替代值,結(jié)果可靠,可推廣應(yīng)用于核磁圖譜的相似性評價。此外,通過對樣本的檢測和相似度分析,發(fā)現(xiàn)不同批次定坤丹大蜜丸相關(guān)系數(shù)較高,且呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P<0.01),表明定坤丹批次間的穩(wěn)定性良好。

本研究首次采用1H-NMR建立了定坤丹的核磁指紋圖譜,該方法可行性強(qiáng),且兩相提取法能較為全面地反映定坤丹的化學(xué)組成,為其內(nèi)在的質(zhì)量評價提供了更加高效的方法,以期更全面、科學(xué)地控制并評價定坤丹的質(zhì)量。