任 潔,胡經(jīng)文,郭統(tǒng)帥,何明俊,劉富強,牟建軍*

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西省分子心臟病學重點實驗室,環(huán)境與疾病相關教育部重點實驗室,西安 710061;2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:jjtalkong@163.com)

鹽是原發(fā)性高血壓的重要環(huán)境因素之一。大量研究表明,鹽的攝入量與心血管疾病的發(fā)生直接相關。血壓的鹽敏感性是指相對高鹽攝入所表現(xiàn)的一種血壓升高的反應[1]。鹽敏感性高血壓可定義為相對高鹽攝入所引起的血壓升高。鹽敏感性高血壓占高血壓人群的28% -74%。不同地區(qū)和種族的人群鹽敏感性存在差異性,流行病學研究表明,血壓的鹽敏感性隨年齡增長而增高。鹽敏感性高血壓患者表現(xiàn)出比心血管疾病患者更高的發(fā)病率和死亡率[2]。

雌激素相關受體(estrogen-related receptors,ERRs)屬于轉錄因子核受體超家族,包括α、β和γ三種亞型[3]。已有研究發(fā)現(xiàn),ERRα與高血壓發(fā)生發(fā)展有密切的關系,但具體影響及作用機制尚不明確。本研究通過構建ERRα過表達大鼠模型研究ERRα對鹽敏感性高血壓大鼠血壓的影響及分子機制,為鹽敏感性高血壓治療和預防提供思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),AKT抗體、p-AKT抗體、SGK1抗體和p-SGK1抗體(美國CST公司),GAPDH兔單克隆抗體(美國Abcam公司),Trizol RNA提取液(美國Invitrogen公司),逆轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術有限公司),熒光定量PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司);ERRα過表達(對照)腺相關病毒AAV9(漢恒生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物

6周齡雄性Dahl鹽敏感性大鼠,SPF級,體質(zhì)量(150 ± 10)g,由陜西省醫(yī)學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)-2011-008。由西安交通大學實驗動物中心飼養(yǎng),室溫(23 ± 2) ℃,相對濕度50% ,光照時間和黑暗時間各12 h。

1.3 分組、感染與造模

建立ERRα心臟過表達的大鼠模型:將24只雄性Dahl鹽敏感性大鼠分為4組,按照腺相關病毒操作說明注射腺相關病毒,兩組為對照病毒組(Dah1-con),尾靜脈注射對照腺相關病毒,兩組為ERRα過表達組(Dah1-ERRα),尾靜脈注射ERRα過表達腺相關病毒(200 μl、1×1012v. p. )。大鼠被注射病毒3周,然后通過Q-PCR檢測ERRα表達。

鹽敏感性高血壓造模:分別取一組ERRα過表達及其對照Dahl大鼠各6只(正常鹽對照組和正常鹽ERRα過表達組),給予正常鹽喂食(含氯化鈉0.5%飼料),另取一組ERRα過表達及其對照Dahl大鼠各6只(高鹽對照組和高鹽ERRα過表達組),給予高鹽喂食(含氯化鈉8%飼料)。喂食大鼠3周,然后檢測各組大鼠造模前后血壓和血漿醛固酮水平。

1.4 血壓檢測

實驗前后采用無創(chuàng)尾動脈測壓儀測定Dah1大鼠血壓。大鼠放入固定儀后,將鼠尾套入無創(chuàng)血壓測量儀,然后在37 ℃下預熱10-15 min,記錄大鼠尾動脈血壓。重復測量3次,取平均值。取收縮壓(mmHg)作為檢測指標。

1.5 血漿抗氧化水平的檢查

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,腹腔注射2.5 ml/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集腹主動脈血液3 ml,離心(2 500 r/min,10 min),取上清,-20 ℃保存。按照試劑盒說明書,檢測各組大鼠血清中SOD和MDA的含量。

1.6 熒光定量PCR檢測mRNA表達

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,迅速分離大鼠主動脈血管,加入液氮碾磨,總RNA提取采用Trizol法,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄試劑盒進行RNA逆轉錄,定量PCR采用SYBR Green染料法進行,根據(jù)SYBR Premix Ex Taq熒光定量試劑盒制造商說明配制PCR體系并在LightCycler?480實時PCR系統(tǒng)上運行,PCR反應采用兩步法,反應條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)Ct值計算出相對表達量。每組3個復孔,3次重復。引物序列見表1。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,迅速分離大鼠胸主動脈組織放于液氮,置于冰上碾磨勻漿,裂解細胞后使用BCA蛋白測定試劑盒對細胞總蛋白進行定量,取總蛋白(25 μg)進行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),電泳后將蛋白轉移至PVDF膜,50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入一抗SGK1(1 ∶500)、p-SGK1(1 ∶500)、AKT(1 ∶500)、p-AKT(1 ∶500),4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(1 ∶5 000),室溫孵育45 min,洗滌后加入顯色液顯色,ImageJ2x軟件用于灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。t檢驗進行兩組間差異比較,單因素方差分析進行多組差異比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高鹽誘導鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高

血壓檢測結果顯示,與正常鹽對照組大鼠相比,高鹽對照組大鼠血壓明顯升高(見圖1)。表明高鹽能夠誘導鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高,鹽敏感性高血壓造模成功。

與正常鹽對照組比較,* *P<0.01圖1 高鹽誘導鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高Figure 1 High salt elevates blood pressure in salt-sensitive hypertensive rats

2.2 高鹽抑制ERRα mRNA表達

熒光定量PCR檢測了高鹽誘導鹽敏感性高血壓大鼠中ERRα mRNA的表達。結果顯示,與正常鹽對照組比較,高鹽對照組高血壓大鼠胸主動脈ERRα mRNA表達顯著降低(見圖2)。

與正常鹽對照組比較,* *P<0.01圖2 高鹽抑制鹽敏感性高血壓大鼠ERRα mRNA表達Figure 2 High salt inhibits ERRα mRNA expression in salt-sensitive hypertensive rats

2.3 ERRα降低鹽敏感性高血壓大鼠血壓

血壓檢測結果表明,與高鹽對照組比較,高鹽ERRα過表達組大鼠血壓顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖3)。

2.4 ERRα抑制鹽敏感性高血壓大鼠氧化應激水平

檢測結果顯示,與正常鹽對照組比較,高鹽對照組大鼠SOD活力顯著降低,MDA含量顯著升高。與高鹽對照組比較,高鹽ERRα過表達組大鼠SOD活力顯著升高,MDA含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖4)。

2.5 ERRα激活AKT/SGK1通路

Western blot研究結果顯示,高鹽ERRα過表達組大鼠AKT磷酸化和SGK1磷酸化水平均明顯高于高鹽對照組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖5)。

與高鹽對照組比較,* *P<0.01圖3 ERRα過表達抑制高鹽誘導的高血壓Figure 3 ERRα overexpression inhibits high salt-induced hypertension in salt-sensitive hypertensive rats

與高鹽對照組比較,* *P<0.01圖4 ERRα對大鼠血清SOD和MDA含量的影響Figure 4 Effect of ERRα on serum SOD and MDA levels in salt-sensitive hypertensive rats

與高鹽對照組比較,* *P<0.01圖5 ERRα促進鹽敏感性高血壓大鼠AKT與SGK1磷酸化Figure 5 ERRα promotes the phosphorylation of AKT and SGK1 in salt-sensitive hypertensive rats

3 討論

隨著人口增長以及人口老年化,高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化等代謝性病發(fā)病率逐年升高,并且增加了心臟病誘發(fā)和惡化的幾率。據(jù)統(tǒng)計,全球范圍內(nèi)大約有11億高血壓患者,且呈現(xiàn)出逐年增多的趨勢[4]。高血壓的主要特征表現(xiàn)為動脈血壓增高,同時可能伴有多器官功能性損害,因此高血壓也是心腦血管病最主要的危險因素。因此,降低血壓的同時,預防和控制引起血壓升高的危險因素或疾病是目前高血壓治療的主要方向[5]。

ERRα是轉錄因子核受體超家族一員。ERRα主要分布在心臟、腎和脂肪組織等代謝活躍的組織器官中,主要通過調(diào)控氧化磷酸化基因的轉錄,對葡萄糖、脂肪等物質(zhì)能量代謝進行調(diào)節(jié)[6]。大量研究表明,ERRα與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關,ERRα在乳腺癌、宮頸癌和結直腸癌等中高表達[7,8]。有研究表明,ERRα與鹽敏感性高血壓的發(fā)生有關,可能與ERRα調(diào)節(jié)β-ENaC和γ-ENaC的表達有關[9]。本研究通過高鹽誘導鹽敏感性高血壓大鼠模型,熒光定量PCR檢測ERRα在高鹽誘導的鹽敏感性高血壓大鼠中的表達,結果表明,ERRα在高鹽誘導的鹽敏感性高血壓大鼠中低表達。過表達ERRα能夠顯著抑制大鼠血壓的升高。揭示ERRα可能與鹽敏感性高血壓大鼠高血壓的發(fā)生有關。

氧化應激是體內(nèi)活性氧介質(zhì)ROS活性過強的一種狀態(tài),與高血壓等代謝性疾病密切相關。在高血壓狀態(tài)下,體內(nèi)氧化平衡被打亂,SOD等抗氧化酶表達減少,導致ROS積累增多,從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的增加,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又能進一步加重氧化損傷[10]。有研究表明,氧化應激可能是鹽敏感性高血壓的一個決定因素,高鹽誘導鹽敏感性高血壓產(chǎn)生時,伴隨血液和腎臟系統(tǒng)氧化應激水平的升高,通過藥物抑制腎臟的氧化應激水平緩解腎損傷能夠有效地緩解高血壓的損傷[11]。本次實驗結果表明,高鹽高血壓模型組大鼠主動脈中SOD活性顯著降低,MDA水平升高,表明高鹽誘導的鹽敏感性高血壓可能與主動脈氧化損傷有關,這與其他學者的研究結果一致。過表達ERRα能夠提高高血壓大鼠血液SOD活性,抑制MDA水平,從而抑制血壓的升高,證實提高機體抗氧化能力并抑制機制氧化應激水平,能夠緩解高血壓的損傷,這與其他學者的研究結果一致。

Akt通路或PI3K/Akt通路是細胞信號傳導中的一條重要通路。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,激活的Akt通過磷酸化一系列細胞內(nèi)蛋白介導下游反應,這些反應包括細胞生長、增殖、遷移和血管生成。血清/糖皮質(zhì)激素誘導蛋白激酶1(SGK1)是AKT下游重要的靶點之一。研究表明,17β-雌二醇能夠激活PI3K/AKT/SGK1通路,抑制LPS誘導的急性肺損傷[12]。本研究中,ERRα促進了AKT的磷酸化水平,激活了AKT/SGK1信號通路,提升SOD活性,抑制MDA水平,提高機體抗氧化能力,從而緩解高血壓的損傷。ERRα是如何通過AKT/SGK1信號通路還需要進一步實驗研究證明。

總之,本研究建立了高鹽誘導的鹽敏感性高血壓大鼠模型,通過構建ERRα高表達大鼠模型,對ERRα與鹽敏感性高血壓和氧化應激之間的關系進行初探,為下一步深入研究提供參考依據(jù),為ERRα在鹽敏感性高血壓的發(fā)生和預防中的進一步研究提供了實驗基礎。