楊孝燕,王春紅,吉宏明
(山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科,太原 030012;*通訊作者,E-mail:hongmingj@sina.com)
原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%[1],呈侵襲性生長(zhǎng),惡性度最高,預(yù)后最差,手術(shù)難全切,即使進(jìn)行手術(shù)聯(lián)合放化療綜合治療,其平均生存期只有50周[2]。與繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不同,在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子突變(TERT啟動(dòng)子突變,TERTp-mut)是發(fā)生率最高的基因突變[3,4],在指導(dǎo)患者預(yù)后方面有重要意義,尤其是聯(lián)合異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase-1,IDH1)分析患者預(yù)后的意義更為明確—TERT啟動(dòng)子突變合并IDH1野生型的患者預(yù)后最差,TERT啟動(dòng)子野生合并IDH1突變型的患者預(yù)后最好,而TERT啟動(dòng)子野生合并IDH1野生型的患者的預(yù)后處于前兩者之間[5,6],但其具體機(jī)制尚未被闡明。
侵襲性生長(zhǎng)是膠質(zhì)瘤預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,有研究證明TERT啟動(dòng)子突變與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)[7],但其中機(jī)制未被明確闡述。與膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)密切相關(guān)的另一研究方向是膠質(zhì)瘤微環(huán)境中極化的小膠質(zhì)細(xì)胞/腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs),因膠質(zhì)瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在形態(tài)功能上很難區(qū)分,以下將二者統(tǒng)稱為TAMs。TAMs分為發(fā)揮促炎作用的M1型與抗炎作用的M2型,而后者有大量研究證明其通過分泌一些因子介導(dǎo)免疫抑制、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲性生長(zhǎng),并有相關(guān)研究證明其分布程度與膠質(zhì)瘤級(jí)別及患者預(yù)后呈正相關(guān),而前者則與抑制腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)[8,9]。M1型TAMs的標(biāo)記物有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IL1、IL6、IL12、IL23、腫瘤壞死因子(TNF);M2型TAMs的標(biāo)記物有精氨酸酶1(Arg-1)、IL10、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF),集落刺激因子1(CSF-1)以及S100 B蛋白、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、前列腺素E2(PGE2)、甘露糖受體[10-12]等。作為炎癥、免疫相關(guān)細(xì)胞,TAMs的極化方向受微環(huán)境中“因子平衡”的調(diào)節(jié),即它會(huì)敏銳地根據(jù)微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子的表達(dá)水平調(diào)整自己的極化方向從而發(fā)揮作用[13]。
在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,TERT啟動(dòng)子突變率高、M2型TAMs分布廣泛,且TERT啟動(dòng)子突變、M2型TAMs均與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性生長(zhǎng)及患者預(yù)后相關(guān),那么二者之間是否存在一定關(guān)系呢?一項(xiàng)關(guān)于酒精性肝炎的研究證明TERT通過調(diào)控核因子κB(NF-κB)影響巨噬細(xì)胞的極化(M1、M2表型)從而引起炎性反應(yīng)[14],故本研究擬初步探討在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TERT啟動(dòng)子突變是否會(huì)促進(jìn)TAMs向M2方向極化。
選取2015-2018年由山西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)治療并經(jīng)病理科診斷為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的石蠟切片79例。選取M2型TAMs的標(biāo)記物為Arg-1,M1型TAMs的標(biāo)記物為iNOS。兔抗人精氨酸酶-1抗體(Arginase-1(D4E3MTM) XP Rabbit mAb,Arg-1)購自Cell Signaling Technology(CST)公司,鼠抗人誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抗體(iNOS Antibody(4E5)NBP2-22119)購自Novusbio公司。酶標(biāo)羊抗鼠/兔二抗及粉劑型抗原修復(fù)液(檸檬酸法)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,抗體稀釋液及DAB試劑盒購自無錫傲銳東源生物科技有限公司。
石蠟標(biāo)本送領(lǐng)星生物科技(上海)有限公司、北京泛生子基因科技有限公司進(jìn)行TERT啟動(dòng)子基因檢測(cè),根據(jù)TERT啟動(dòng)子突變否將原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本分為TERT啟動(dòng)子突變組(TERTp-m)與TERT啟動(dòng)子野生組(TERTp-w)。兩組分別用免疫組化SP法檢測(cè)Arg-1、iNOS的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。保存于病理科的石蠟切片經(jīng)過脫蠟、水化、高壓法抗原修復(fù)、孵育一抗及二抗、DAB顯色、復(fù)染及封片,后于400倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)胞質(zhì)或胞核黃染或棕黃色染色的陽性細(xì)胞數(shù)。
陽性表達(dá)均為棕色染色,且Arg-1、iNOS均為胞核、胞質(zhì)染色。而Arg-1表達(dá)與血管關(guān)系密切,有明顯在血管壁、血管內(nèi)、血管周表達(dá)傾向。無論TERT啟動(dòng)子突變組還是TERT啟動(dòng)子野生組鏡下觀iNOS陽性細(xì)胞(M1型TAMs)數(shù)均明顯多于Arg-1陽性細(xì)胞(M2型TAMs)數(shù)(見圖1)。
在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,TERT啟動(dòng)子突變組的Arg-1陽性細(xì)胞(M2型TAMs)數(shù)較TERT啟動(dòng)子野生組多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(22.85 ± 10.33vs2.85 ± 1.70,P<0.05);突變組的iNOS陽性細(xì)胞(M1型TAMs)數(shù)比野生組多,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(394.20 ± 118.74vs356.34 ± 68.32,P=0.080,見表1)。
表1 TERTp-m與TERTp-w組Arg-1、iNOS陽性細(xì)胞數(shù)比較
與TERTp-w組比較,*P<0.05
膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的小膠質(zhì)細(xì)胞/腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有兩種來源,一是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞極化而來,另一種是外周循環(huán)中的單核細(xì)胞被招募到膠質(zhì)瘤微環(huán)境中,二者在功能、形態(tài)上很難區(qū)分,共同發(fā)揮作用,一般通稱為TAMs。靜息狀態(tài)下的TAMs呈細(xì)枝狀的阿米巴樣,為M0型,有兩種極化途徑:經(jīng)典極化途徑產(chǎn)生的M1型和替代極化途徑產(chǎn)生的M2型,M2型又分為M2a、M2b、M2c三種亞型[12]。研究報(bào)道在非惡性腫瘤中以M1型為主,發(fā)揮促炎作用殺滅微環(huán)境中的病原體、促進(jìn)腫瘤消融或死亡;在惡性腫瘤則以M2型為主,發(fā)揮免疫抑制、促腫瘤侵襲性生長(zhǎng)等作用[8,11]。Arg-1在M2型TAMs的標(biāo)記物中是最穩(wěn)定的[10],與M1型標(biāo)記物iNOS競(jìng)爭(zhēng)底物、功能拮抗[12],故本實(shí)驗(yàn)選取M1型標(biāo)記物iNOS、M2型標(biāo)記物Arg-1。
研究中發(fā)現(xiàn)無論在TERT啟動(dòng)子突變組還是野生組,鏡下均見大量的iNOS陽性細(xì)胞(M1型),幾乎充滿視野,且背景棕染,而Arg-1陽性細(xì)胞(M2型)則少量聚集分布,與之前的結(jié)論—惡性膠質(zhì)瘤中TAMs以M2型為主—相反,對(duì)此查閱相關(guān)文獻(xiàn)后可能的解釋有以下三點(diǎn):首先,因得出惡性膠質(zhì)瘤中TAMs以M2型為主的結(jié)論的研究采用的M1、M2型標(biāo)記物多是免疫表型標(biāo)記物,比如CD163、CD16、CD68、CD11、CD206等[10,12,13],而iNOS和Arg-1是其代謝途徑的酶,所以導(dǎo)致不同的結(jié)果,而由此可以推測(cè),M1、M2型TAMs的代謝并不是完全分離的,二者之間可能存在交叉,也提示腫瘤及其微環(huán)境的細(xì)胞的代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用;其次,有研究推測(cè)M1型和M2型TAMs在相互轉(zhuǎn)化時(shí)可能存在某種中間形式以序貫其功能[15],由此推測(cè),iNOS不僅僅是M1型TAMs的產(chǎn)物,也可能是M1、M2型轉(zhuǎn)化之間存在的某種中間型的產(chǎn)物;最后,因TAMs對(duì)腫瘤微環(huán)境的因子變化非常敏感,會(huì)根據(jù)微環(huán)境的變化而改變極化狀態(tài)[16],故進(jìn)一步推測(cè),在膠質(zhì)瘤發(fā)生時(shí),膠質(zhì)瘤及其微環(huán)境介質(zhì)釋放某些因子招募小膠質(zhì)細(xì)胞/單核細(xì)胞并促使其向M1型極化以啟動(dòng)機(jī)體“自衛(wèi)”程序,但在腫瘤進(jìn)展過程中,微環(huán)境的改變又促使TAMs向M2方向極化,極化的M2型TAMs則進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤侵襲性生長(zhǎng),由此導(dǎo)致膠質(zhì)瘤中M1型標(biāo)記物iNOS較M2型標(biāo)記物Arg-1多。此外,本研究發(fā)現(xiàn)Arg-1的表達(dá)與血管有明顯的關(guān)系,在血管壁、血管周、血管內(nèi)表達(dá)較明顯,驗(yàn)證了M2型TAMs在促進(jìn)腫瘤血管形成與腫瘤發(fā)展中扮演著重要角色的結(jié)論[8,9]。
在本研究中,TERT啟動(dòng)子突變組的Arg-1表達(dá)要比野生組多,iNOS表達(dá)兩組無差異性,即TERT啟動(dòng)子突變組較之TERT啟動(dòng)子野生組,M2型細(xì)胞多,M1型細(xì)胞數(shù)無差異性,初步驗(yàn)證了TERT啟動(dòng)子突變促使TAMs向M2型極化的假設(shè)。TERT啟動(dòng)子突變是原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)生率最高的基因突變[3,4],與膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)[7],另外有關(guān)TERT啟動(dòng)子突變與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的研究結(jié)論尚未統(tǒng)一,但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中結(jié)論是確定的,即有TERT啟動(dòng)子突變的患者預(yù)后是最差的[5,6];M2型TAMs與膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)和患者不良預(yù)后也有關(guān)[8,9],本研究初步證明TERT啟動(dòng)子突變與TAMs向M2型細(xì)胞極化,啟示我們二者可能共同作用于原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲性生長(zhǎng)及患者的不良預(yù)后;而TERT啟動(dòng)子突變是通過何種途徑調(diào)節(jié)TAMs的極化方向以及TAMs在促進(jìn)原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性生長(zhǎng)、預(yù)后差的機(jī)制則需進(jìn)一步研究。