袁琳，張建潔，陳雪，鄭艷，姚燕，李平

（1.華北石油管理局總醫(yī)院 1.婦科，2.耳鼻喉科，河北 任丘 062552）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis,EMS）是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮腔被覆內(nèi)膜以外的部位生長、浸潤的一種慢性婦科疾病[1]。流行病學(xué)資料顯示，約5%～10%育齡婦女患子宮內(nèi)膜異位癥，其中50%患者存在生育問題[2]。EMS 的診斷主要憑借腹腔鏡檢查，但其具有高侵入性且在EMS 晚期發(fā)揮作用。超聲及其他成像技術(shù)在EMS 的診斷和分期方面準(zhǔn)確性不高[3]。目前缺乏高效的EMS 早期血清診斷標(biāo)志物。雖然一些EMS 患者的血清CA-125 升高，但并不是特異性的，而且敏感性也較差。因此，尋找一種非侵入性的，高效的EMS 早期診斷標(biāo)志物顯得尤為重要。microRNAs（miRNAs）是一種小的，具有21 ～22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 分子。miRNAs 通過基因沉默在轉(zhuǎn)錄后的水平或催化轉(zhuǎn)錄本降解，調(diào)控許多生物過程[4]。 由于成熟的miRNAs 能夠與蛋白復(fù)合物結(jié)合，所以miRNAs 既存在于細(xì)胞內(nèi)，也穩(wěn)定存在于血清中，這使其成為具有診斷各種疾病的生物標(biāo)志物的潛力[5-6]。另外，血清miRNAs 表達(dá)穩(wěn)定，重復(fù)性好，個(gè)體間差異小，其特異性表達(dá)模式已被認(rèn)定為包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的生物標(biāo)志物[7]。血液中miRNA 水平的改變可能反映正常生理過程中的變化[8-9]，并與一些病理?xiàng)l件有關(guān)，如婦科一些常見疾病[10-11]。在與EMS 密切相關(guān)的失調(diào)miRNAs 中，miR-122-5p 與miR-199a-5p 在EMS 患 者的血清中表達(dá)增強(qiáng)，且與疾病病理分期呈正相關(guān)，兩者的血清濃度也呈正相關(guān)。同時(shí)，兩者的靶基因均為凋亡相關(guān)的，在子宮內(nèi)膜癌的分化中發(fā)揮重要作用的基因SOX4，故兩者聯(lián)合診斷EMS 具有很好的前景[12]。 此外，EMS 的炎癥標(biāo)志物還存在爭議，有研究證實(shí)，EMS 與健康女性的白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）水平比較無差異，而另有研究表明，EMS 患者的IL-6 水平較高[13]。故本研究將評估血清miR-122-5p、miR-199a-5p 及IL-6 在EMS 早期診斷中的價(jià)值及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究是一項(xiàng)前瞻性研究，隨機(jī)選取2016年 1月—2017年12月華北石油管理局總醫(yī)院診治的EMS 患者90 例（EMS 組）及同期盆腔疼痛或不孕癥檢查的患者70 例（對照組）為研究對象。其中EMS患者均經(jīng)腹腔鏡診斷，組織病理學(xué)檢查證實(shí)。根據(jù)經(jīng)修訂的美國生殖醫(yī)學(xué)分類學(xué)會，EMS 被分為輕度/輕度（Ⅰ、Ⅱ期）或中度/重度（Ⅲ、Ⅳ期）[14]。對照組包括所有接受腹腔鏡手術(shù)治療盆腔疼痛、不孕癥或良性腫瘤，但未被診斷為EMS 的婦女。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腹腔鏡前3 個(gè)月內(nèi)接受藥物治療；子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜癌/增生、子宮內(nèi)膜息肉。②慢性或急性炎癥性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤。③身免疫性疾病和心血管疾病。研究內(nèi)容和方法均經(jīng)受試者知情并簽署同意書，且經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 樣本采集及檢測方法

所有受試者于術(shù)前清晨空腹抽靜脈血，3 000 r/min離心15 min，分離出血清后于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩hermo Fisher miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒、Thermo Fisher qPCR Super Mix 試劑盒均購自美國Thermo Fisher 生物技術(shù)有限公司，引物由美國Invotrigen 公司設(shè)計(jì)并合成，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測IL-6 的濃度，由深圳欣博生物科技有限公司提供。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢 測miR-122-5p 和miR-199a-5p 的 表 達(dá)（SYBRGreen 法）。U6 RNA 作為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 保存在4℃。實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）反應(yīng)體系：10 μl cDNA，12.5 μl SYBR Green Master Mix，0.5 μmol/L 引物，RNase-free 水補(bǔ)充體積至25 μl。Real-time PCR 檢測采用7500 real-time PCR System（美國Applied Biosystems 公司）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性10 s，57℃退火30 s，75℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。檢測miRNA 的相對表達(dá)水平，以U6 為內(nèi)參基因，對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理。血清中miRNA 的相對表達(dá)水平計(jì)算公式如下：RQ=2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析，ROC 曲線分析血清miR-122-5p 和miR-199a-5p的最佳截?cái)嗨?，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

兩組患者年齡、體重指數(shù)（BMI）、臨床癥狀比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；生育史比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 一般臨床資料比較

2.2 兩組患者血清IL-6 水平及miR-122-5p、miR-199a-5p 的表達(dá)

EMS 組患者的血清IL-6 水平及miR-122-5p 與miR-199a-5p 的表達(dá)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EMS 組患者增高。見表2和圖1。

2.3 血清miR-122-5p 與miR-199a-5p 的表達(dá)與EMS 患者的臨床病理特征關(guān)系

不同病理分期的EMS 患者中，血清miR-122-5p與miR-199a-5p 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 兩組患者血清IL-6 水平及miR-122-5p 與 miR-199a-5p 的表達(dá) （±s）

表2 兩組患者血清IL-6 水平及miR-122-5p 與 miR-199a-5p 的表達(dá) （±s）

組別 n IL-6/（pg/ml） miR-122-5p miR-199a-5p EMS 組 90 51.67±12.11 4.23±0.82 4.59±1.01對照組 70 17.92±10.17 1.65±0.33 1.17±0.22 t 值 18.741 24.826 27.863 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 EMS 患 者 血清IL-6 水 平、miR-122-5p、miR-199a-5p 表達(dá)的相關(guān)性

EMS 患者血清IL-6 水平、miR-122-5p、miR-199a-5p 的表達(dá)呈正相關(guān)。見表4。

2.5 EMS 患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p表達(dá)的診斷效率

表3 血清miR-122-5p 與miR-199a-5p 的表達(dá)與 EMS 患者的臨床病理特征關(guān)系 （±s）

表3 血清miR-122-5p 與miR-199a-5p 的表達(dá)與 EMS 患者的臨床病理特征關(guān)系 （±s）

病理分期 n miR-122-5p miR-199a-5pⅠ、Ⅱ 38 4.31±0.68 4.98±1.23Ⅲ、Ⅳ 52 4.26±0.17 5.06±1.07 t 值 0.453 0.325 P 值 0.651 0.746

圖1 兩組患者血清miR-122-5p 與miR-199a-5p 的表達(dá)水平 （±s）

表4 EMS 患者血清IL-6 水平、miR-122-5p、miR-199a-5p 表達(dá)的相關(guān)性

EMS患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 表達(dá)的診斷效率以ROC 曲線下面積（AUC）表示。見表5和圖2。

表5 EMS 患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 表達(dá)的診斷效率

圖2 EMS 患者血清miR-122-5p 與miR-199a-5p 表達(dá)的ROC 曲線

3 討論

目前，EMS 的診斷和評估主要憑借腹腔鏡，但由于腹腔鏡技術(shù)具有高侵襲性，且診斷的EMS 大多數(shù)處于疾病晚期，故開發(fā)用于EMS 早期階段的敏感性及特異性高的生物標(biāo)志物顯得尤為迫切。本研究中，EMS患者的血清miR-122-5p、miR-199a-5p 及IL-6 的水平升高，血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 用于檢測EMS 的敏感性分別為94.7%和92.1%，特異性分別為90.5%和88.6%，提示這些分子有可能成為診斷EMS生物標(biāo)志物的潛力。此外，相關(guān)性分析得出，miR-122-5p 的表達(dá)與IL-6、miR-199a-5p 表達(dá)呈正相關(guān)，這說明miRNAs 聯(lián)合炎癥因子檢測EMS 具有較高的診斷準(zhǔn)確率。

miRNAs 在多種生理和病理?xiàng)l件下起著重要的作用。在各種類型的癌癥中，包括實(shí)體瘤、白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、卵巢癌和其他疾病，如糖尿病和肝硬化，均檢測到血漿miRNAs 的變化[15]。由于血清標(biāo)志物的獲取方便，測量方法簡單可行。因此，其在早期診斷EMS 具有很好的應(yīng)用前景。然而，先前的研究主要集中在子宮內(nèi)膜組織中miRNAs 的表達(dá)。LIU 等[16]通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析子宮內(nèi)膜腺癌組織中表達(dá)異常的mRNA，miRNA 與DNA 甲基化相關(guān)基因，最終確定出異常變化的DEGs，包括ZEB1、ZEB2、TIMP2、TCF4、CYP1B1、PITX1、PITX2、ZNF154 及TSPYL5等有望成為治療子宮內(nèi)膜腺癌的靶點(diǎn)。循環(huán)miRNAs用于早期診斷EMS 的研究是一個(gè)新的領(lǐng)域，相關(guān)的研究報(bào)道較少[17]。WANG 等[18]對子宮內(nèi)膜異位癥和健康女性患者的血清miRNA 表達(dá)的研究表明，miR-122和miR-199a 的水平升高，miR-145、miR-141、miR-542-3p 及miR-9 在EMS 患者中的水平降低，并提出該化合物可以作為其潛在的生物標(biāo)志物。同時(shí)，研究還指出miR-122a 和miR-199a 的表達(dá)可能用于評估疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果提示，miR-122a 和miR-199a 的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度無相關(guān)性。還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，多中心進(jìn)行研究。WANG 等[18]對30 例輕度子宮內(nèi)膜異位癥患者和20 例對照組女性血清樣本的miRNAs 表達(dá)進(jìn)行評估。通過深度測序，發(fā)現(xiàn)有98 個(gè)miRNAs 被下調(diào)，10 個(gè)miRNAs 被上調(diào)。這可能是由于抽樣技術(shù)和分析方法的不同造成[19]。

綜上所述，與對照組比較，子宮內(nèi)膜異位癥患者的血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 的水平升高，且診斷效率較高。因此，這些miRNAs 有望成為診斷子宮內(nèi)膜異位癥生物標(biāo)志物的潛力。此外，本研究還存在缺乏腹腔鏡檢查EMS 后患者的用于評估該miRNAs 穩(wěn)定性的隨訪資料，后續(xù)深入研究為血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 成為EMS 診斷標(biāo)志物提供證據(jù)。