蔡銳文，梁偉成，黃冀華，梁華艷，黃開勁，鄧波

（廣東省高州市人民醫(yī)院 1.胃腸外科，2.檢驗(yàn)科，廣東 高州 525200）

微RNA（MicroRNA,miR）作為廣泛存在于生物體內(nèi) 的短鏈核糖核酸（ribonucleic acid,RNA），可通過影響 靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯而參與多種生理病理過程[1]，同時(shí)，在多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[2]。miR-29a 作為miR-29 家族重要成員，與乳腺癌[3]、膠質(zhì)瘤等[4]惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。本研究擬分析miR-29a 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)，采用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）特異性抑制結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞中miR-29a 表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般研究

1.1.1 臨床資料 選取2013年3月—2016年4月在廣東省高州市人民醫(yī)院治療的結(jié)直腸癌患者195 例，術(shù)前均未行放化療治療，均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。其中，男性109 例，女性86 例；年齡33 ～82 歲，平均（60.1±12.8）歲；腫瘤部位：結(jié)腸91 例，直腸104 例；TNM 分期：Ⅰ期35 例，Ⅱ期64 例，Ⅲ期81 例，Ⅳ期15 例；分化程度：低分化17 例，中分化166 例，高分化12 例。所有患者均于術(shù)中留取結(jié)直腸癌及距離腫瘤邊緣＞4 cm 處的癌旁組織，生理鹽水清洗后置于液氮中，置入-80℃冰箱冷凍保存。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 人結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，Trizol 總RNA 提取試劑盒、LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、Matrigel 膠購自美國(guó)Invitrogen 公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國(guó)Gibco 公司，逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，MTT 試劑盒、DMSO 購自美國(guó)Sigma 公司，Transwell 小室購自德國(guó)Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中miR-29a 表達(dá) 取結(jié)直腸癌和癌旁組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞中總miR，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總miR 純度，以A260/A280 在1.80 ～2.10作為合格樣品。將總miR 逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，利用PCR 試劑盒進(jìn)行PCR，引物序列為：正向5'-CG GCGGTAGCACCATCTGAAAT-3'，反向5'-CCAGTGCA GGGTCCGAGGTA-3'；U6 引物：正向5'-GGAGAGTGT TTCCTCGTCCC-3'，反向5'-ATGAAGGGGTCGTTGATG GC-3'。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，73℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)38 次，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)直腸癌和癌旁組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量[5-6]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將LoVo 細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于含5%二氧化碳CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，胰酶消化后，接種于6 孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度在80%左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：①ASO-miR-29a 組：利用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染miR-29a 的ASO 序列5'-ACTGATTTCTTTT GGTGTTCAG-3'；②ASO-對(duì)照序列組：5'-TCATTGGC ATGTACCATGCAGCT-3'；③空白對(duì)照組：不作任何處理。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR檢 測(cè) 各 組 細(xì) 胞 中miR-29a 表 達(dá) 取各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，其余步驟同1.2.1。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 取各組細(xì)胞，胰酶消化后，離心取細(xì)胞沉淀，重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml，各取100 μl 加入96 孔板，各組均設(shè)6 個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72 和96 h 時(shí)，將20 μl 的MTT 液加入各孔，孵育4 h，將孔內(nèi)培養(yǎng)液去除，各加入150 μl 的DMSO 液，振蕩15 ～20 min 待沉淀完全溶解后，利用酶標(biāo)儀取570 nm 處對(duì)各孔吸光度（A）值進(jìn)行檢測(cè)[7]。

1.2.5 Transwell 小室檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml。取200 μl 單細(xì)胞懸液置于Transwell 小室上室，將800μl 的含20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室下室，于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h。將小室取出后，用PBS 沖洗3 次，用棉簽輕輕將小室上散落細(xì)胞擦除，多聚甲醛室溫下固定15 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS 沖洗3 次，用倒置顯微鏡觀察，拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)[7]。

1.2.6 Transwell 小室檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力 取Matrigel 膠預(yù)先平鋪于Transwell 小室上室，風(fēng)干后以備用。其余步驟同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)、方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，影響因素分析采用多元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中miR-29a 表達(dá)比較

結(jié)直腸癌組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量為（1.93± 0.19），癌旁組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量為（1.26± 0.12），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.596，P= 0.000）。

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小和分化程度結(jié)直腸癌組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)的因素。見表1。

2.3 結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)影響因素分析

多元線性回歸分析結(jié)果顯示，TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)的因素（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組細(xì)胞中miR-29a 表達(dá)比較

3 組細(xì)胞中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.14± 0.07）、（1.84±0.12）和（1.82±0.21），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.940，P=0.000），兩兩比較，ASO-miR-29a 組細(xì)胞中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量低于ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞增殖能力比較

3 組細(xì)胞24、48、72 和96h 時(shí)A 值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的A 值有差異（F=46.351，P=0.000）。②3 組時(shí)間A 值有差異（F=102.861，P=0.000），ASO-miR-29a 組與ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組相比A 值比較低，細(xì)胞增殖被抑制。③3 組的A 值變化趨勢(shì)有差異（F=21.573，P=0.000）。見表3。

表1 不同因素對(duì)結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)水平的影響 （±s）

表1 不同因素對(duì)結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)水平的影響 （±s）

影響因素 n miR-29a 表達(dá)量 t 值 P 值年齡 ≥60 歲 100 1.95±0.21 0.150 0.440＜60 歲 95 1.92±0.16性別 男 109 1.91±0.15 1.272 0.102 女 86 1.97±0.22腫瘤部位 結(jié)腸 91 1.90±0.14 1.288 0.100 直腸 104 1.96±0.20腫瘤大小 ≥5 cm 94 1.94±0.22 1.002 0.159＜5 cm 101 1.91±0.17 TNM 分期 Ⅰ、Ⅱ期 99 1.72±0.15 14.776 0.000 Ⅲ、Ⅳ期 96 2.16±0.24分化程度 低分化 17 1.98±0.25 1.353 0.089 中、高分化 178 1.92±0.18淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是 93 2.20±0.23 12.738 0.000 否 102 1.81±0.13

2.6 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

3 組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組比較，ASO-miR-29a 組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、2 和表4。

表2 結(jié)直腸癌組織中miR-29a 表達(dá)影響因素的多元線性回歸分析

表3 各組細(xì)胞增殖能力比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞增殖能力比較 （±s）

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h ASO-miRNA-29a 組 0.15±0.04 0.26±0.05 0.31±0.05 0.41±0.14 0.57±0.10 ASO-對(duì)照序列組 0.17±0.06 0.40±0.07 0.48±0.05 0.64±0.12 0.80±0.12空白對(duì)照組 0.18±0.02 0.41±0.12 0.49±0.06 0.60±0.10 0.87±0.14

圖1 各組細(xì)胞遷移能力比較 （結(jié)晶紫×400）

圖2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 （結(jié)晶紫×400）

表4 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 （個(gè)，x±s）

3 討論

結(jié)直腸癌作為消化道發(fā)病率僅次于胃癌的惡性腫瘤，是我國(guó)三大癌癥之一，目前尚無特效的治療手段，多數(shù)患者預(yù)后較差，給我國(guó)人群及社會(huì)帶來沉重的疾病負(fù)擔(dān)[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR 可通過發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用而參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程。亦有研究指出[10]，miR 參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程。有研究指出[11]，結(jié)直腸癌患者外周血中多種miR 出現(xiàn)表達(dá)異常，其靶基因可能在結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。miR-29a 位于人染色體7q32 上，可通過發(fā)揮促癌或抑癌基因功能而參與多種腫瘤發(fā)生[12-13]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，說明miR-29a 在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，可能參與了結(jié)直腸癌發(fā)生過程。

本研究結(jié)果顯示，TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌組織中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量的影響因素，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量增加，進(jìn)一步說明miR-29a 可能參與結(jié)直腸癌病程進(jìn)展過程。為進(jìn)一步探討miR-29a 在結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用，本研究利用ASO 技術(shù)特異性抑制結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞中miR-29a 表達(dá)，結(jié)果顯示，ASO-miR-29a 組細(xì)胞中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量低于ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組，說明LoVo 細(xì)胞中miR-29a 基因表達(dá)被抑制。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASO-miR-29a 組與ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組相比A 值降低，說明特異性抑制miR-29a 基因表達(dá)可減少LoVo 細(xì)胞增殖，提示miR-29a 可能與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與ASO-對(duì)照序列組和空白對(duì)照組比較，ASO-miR-29a 組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，說明特異性抑制miR-29a 基因表達(dá)可有效減少LoVo 細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示miR-29a 可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲過程。

目前，miR-29a 已證實(shí)與多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，且參與了腫瘤多藥耐藥[14]，為腫瘤期診斷、分期及預(yù)后判定提供了可靠生物學(xué)標(biāo)志物，有望為包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的靶向治療提供新的靶點(diǎn)，但鑒于腫瘤發(fā)生涉及多基因、多步驟，miR-29a在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步開展后續(xù)研究以明確。

綜上所述，miR-29a 在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，參與結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展過程，特異性抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-29a 表達(dá)可減少細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。