鐘敏，蘇群豪，胡敏，徐璐，陶石

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，海南 ?？?570102）

白血病是由造血干/祖細(xì)胞分化、凋亡失調(diào)和惡 性增殖引起的一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。大量研究表明，血液中有微量的細(xì)胞群，僅占白血病細(xì)胞的0.1%～1.0%，稱為白血病干細(xì)胞[1]。這些細(xì)胞通常會(huì)導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)，對(duì)化療藥物敏感性降低，耐藥性增加。急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myelocytic leukemia,AML）是一種起源于髓系造血干/祖細(xì)胞的惡性腫瘤。臨床表現(xiàn)包括貧血、出血、感染、發(fā)熱、臟器浸潤和代謝異常。大多數(shù)病例表現(xiàn)為急性和重度狀態(tài)，預(yù)后較差。白血病干細(xì)胞的免疫表型在不同類型的白血病和個(gè)體間有差異，與臨床特征、治療反應(yīng)、生存和預(yù)后有關(guān)[2]。作為免疫球蛋白超家族的成員，CD96 在大多數(shù)CD34+CD38+的AML 干細(xì)胞上表達(dá)。據(jù)報(bào)道，CD96 的表達(dá)與白血病干細(xì)胞的功能有關(guān)[3]。新近研究證實(shí)在不同的人AML 細(xì)胞移植小鼠模型中，所有的未成熟AML 亞群細(xì)胞中的白血病干細(xì)胞表達(dá)IL-3受體α 鏈（CD123）[4]。目前，AML 中白血病干細(xì)胞相關(guān)抗原CD123、CD96 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究探討AML 中白血病干細(xì)胞相關(guān)抗原CD123、CD96 與療效、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2013年6月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科住院治療的156 例AML 患者為研究對(duì)象。其中，男性86 例，女性70 例；年齡15 ～ 49 歲，平均（38.2±10.5）歲。所有患者診斷符合2016年WHO 修訂版造血和淋巴組織腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。FAB 分類：M1 27 例，M2 35 例，M3 25 例，M4 40 例，M5 29 例。選取同期在本院健康體檢者150 例作為對(duì)照組。其中，男79 例，女71 例；年齡18 ～56 歲，平均（46.5±20.1）歲。所有患者都知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

治療方案及療效標(biāo)準(zhǔn)：AML 患者除急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia,APL）外采用三尖杉酯堿（HA）誘導(dǎo)治療2 ～3mg/d，5 ～7 d 或米托蒽醌（NA）10mg/d，3 d，其次是阿糖胞苷150 ～ 300mg/d，鞏固5 ～7 d。APL 患者主要用亞砷酸鈉誘導(dǎo)，或亞砷酸和視黃酸雙重誘導(dǎo)治療。除化療外，所有患者均給予輸血、抗感染與綜合支持治療。療效評(píng)價(jià)基于血液病診斷和規(guī)范治療準(zhǔn)則：①完全緩解（CR）：無貧血、出血、感染或白血病細(xì)胞浸潤性表現(xiàn)；血紅蛋白＞90g/L，白細(xì)胞正?；驕p少，無未成熟細(xì)胞，血小板＞100×109/L；原始細(xì)胞和早期細(xì)胞骨髓中的嬰兒期細(xì)胞（或未成熟細(xì)胞）＜5%，正常紅細(xì)胞和巨核系。②部分緩解（PR）：臨床、血液和骨的3 個(gè)方面中的1 個(gè)或2 個(gè)方面骨髓不符合CR 標(biāo)準(zhǔn)；骨髓原始細(xì)胞和早期幼稚細(xì)胞＜20%。③無緩解（NR）：臨床、血液和骨髓方面未能滿足CR 骨髓中的原始細(xì)胞和早期幼稚細(xì)胞＞20%，包括無效患者。

所有患者隨訪5年，方式為電話或門診，記錄生存時(shí)間、化療后感染、化療后復(fù)發(fā)、髓外浸潤等情況。

1.2 免疫分型檢測

采用乙二胺四乙酸（EDTA）提取骨髓2 ～5ml?；熐安捎妹芏忍荻入x心法分離骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離單個(gè)核細(xì)胞。分別使用4 種顏色熒光標(biāo)記的FITC-CD34、PE-CD38、PACP-CD123 及APC-CD96 抗體（購自美國BD 公司）檢測細(xì)胞。室溫避光孵育10 min。1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，最后加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）300 μl 混勻懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測分析CD123、CD96 表達(dá)。FSC/SSC 排除碎片，SSC/CD45 作為空白對(duì)照，CD34+CD38-為造血干細(xì)胞。此外，CD123+是設(shè)置CD34+CD38-造血干細(xì)胞鑒定白血病干細(xì)胞。若是超過陰性對(duì)照20%就確定為抗原表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank-χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD96、CD123 在AML 患者中的表達(dá)

AML 患者CD96 陽性表達(dá)率為（12.85±9.04）%，CD123 陽性表達(dá)率為（41.24±10.42）%；對(duì)照組：CD96 陽性表達(dá)率為（0.26±0.06）%，CD123 陽性表達(dá)率為（0.73±0.21）%；AML 患者的CD96 與CD123 陽性表達(dá)率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.300 和34.328，均P=0.000）。見圖1。

2.2 AML 患者中CD96、CD123 表達(dá)與臨床療效的關(guān)系

AML 患者中CD96、CD123 陽性表達(dá)的緩解率低于CD96、CD123 陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 AML 患者CD96、CD123 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

圖1 AML 患者中CD96、CD123 的表達(dá)情況

表1 CD96、CD123 表達(dá)與臨床療效的關(guān)系 例

AML 患者中CD96、CD123 陽性表達(dá)的生存率低于CD96、CD123 陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 陽性表達(dá)的化療后感染、化療后復(fù)發(fā)發(fā)生率高于CD96、CD123 陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 陽性表達(dá)的髓外浸潤發(fā)生率高于CD96、CD123 陰性表達(dá)者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 AML 患者CD96 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 [n =78，例（%）]

表3 AML患者CD123表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 [n =78，例（%）]

AML 患者中CD96 陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者中位生存期分別為（29.33±6.12）和（36.07±8.53）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.670，P=0.000）。AML 患者中CD123 陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者中位生存期分別為（30.51±10.01）和（35.77±8.91）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.467，P=0.001）。見圖2。

圖2 CD96、CD123 不同表達(dá)患者生存率比較

3 討論

多項(xiàng)研究表明，AML 的發(fā)病與白血病干細(xì)胞密切相關(guān)[6]。白血病干細(xì)胞是一群具有自我更新能力的細(xì)胞群，可產(chǎn)生異質(zhì)性白血病細(xì)胞群，在白血病細(xì)胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起重要作用。針對(duì)靶向白血病干細(xì)胞的多種生物治療方法，如CD33 單克隆抗體、CD44 單克隆抗體和IL-3 細(xì)胞因子偶聯(lián)細(xì)胞毒素，取得良好的臨床效果。白血病干細(xì)胞是由正常造血干細(xì)胞基因突變?cè)诎l(fā)育過程中產(chǎn)生，因此具有與正常造血干細(xì)胞相同的表型，如CD34+CD38-、HLA-DR 和CD71。然而也有不同的表型與造血干細(xì)胞，如CD117和CD90。因此，檢測白血病細(xì)胞表面特異性抗原標(biāo)志物，預(yù)測疾病治療反應(yīng)及預(yù)后更具有重要的臨床意義。

CD123 是IL-3 受體的α 亞基，在成人正常骨髓單核細(xì)胞中所占比例很低（0.1%～0.6%）[7]。相反，CD123 被發(fā)現(xiàn)在CD34-細(xì)胞的陽性率為2%。CD123廣泛表達(dá)在大多數(shù)AML 原始細(xì)胞及白血病干細(xì)胞表面，且與AML 不良預(yù)后相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)超過45%的AML 患者白血病細(xì)胞高表達(dá)CD123，且與AML 預(yù)后密切相關(guān)[8]。國外研究表明，CD34+CD38-CD123+細(xì)胞可誘導(dǎo)和維持白血病細(xì)胞，提示該組細(xì)胞具有白血病干細(xì)胞特征，CD34+CD38-CD123+可作為白血病干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[9]。

CD96 是免疫球蛋白超家族 CD226 亞家族的組成部分之一，已報(bào)道在T 和NK 細(xì)胞中表達(dá)，但在B 細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或紅細(xì)胞中不表達(dá)[10]。有報(bào)道稱CD96 在AML 中表達(dá)率為30%，不受疾病亞型的影響[11]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，AML 患者高表達(dá)CD96，且CD96 陽性表達(dá)患者緩解率更低，復(fù)發(fā)率高[12]。另外研究發(fā)現(xiàn)[13]，AML 患者CD96、CD123 表達(dá)率高于ALL 患者，且兩者化療緩解率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD96 與AML 的耐藥有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41.2%、12.8%的AML 患者白血病干細(xì)胞表達(dá)CD123、CD96，分別高于對(duì)照組患者。療效分析顯示CD123、CD96 陽性表達(dá)AML 患者的緩解率低于CD123、CD96 陰性表達(dá)患者，生存分析發(fā)現(xiàn)CD123、CD96 陽性表達(dá)AML 患者的化療后感染、化療后復(fù)發(fā)發(fā)生率更高，中位生存期更短。提示白血病干細(xì)胞高表達(dá)CD123、CD96 的AML 患者預(yù)后更差，為臨床判斷AML 患者預(yù)后及指導(dǎo)治療決策提供簡便易行的評(píng)估手段。

綜上所述，通過對(duì)CD123、CD96 表達(dá)的檢測可用于評(píng)價(jià)AML 患者化療療效及生存預(yù)后，分辨出耐藥性高的患者，以便早期干預(yù)。同時(shí)，靶向CD123、CD96 的細(xì)胞免疫治療成為今后研究的方向。不過還有待于大量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，觀察不同亞型患者CD96、CD123 表達(dá)情況及預(yù)后，這也是今后研究的方向之一。