張琪，楊光華，黃志強(qiáng)，葛志鵬，劉少鵬，田煒，張國志，王長友

（1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000；2，華北理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)實驗中心，河北 唐山 063000）

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升且年輕化發(fā)展趨勢[1-2]。腫瘤壞死因子α 轉(zhuǎn)換酶，又稱解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloprotease 17,ADAM17）[3]，有著水解剪切酶類作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用，且對腫瘤患者的生存預(yù)后有一定的提示意義[4-5]。惡性侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞惡性病因的原因之一。因此，本研究通過抑制HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞ADAM17 的表達(dá)，探討其對HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞體外侵襲的影響作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞株（購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國Gibco 公司），Trizol、Go ScriptTM逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、real-time PCR 試劑盒（美國Invitrogen 公司），Transwell 小室、Matrigel膠（美國BD 公司），抗體ADAM17（美國Abcom 公司），磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylation extracellular regulated protein kinases,p-ERK）、細(xì)胞外調(diào) 節(jié) 蛋 白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matri metalloproteinase-9,MMP-9）及β-actin 抗體（美國Sigma 公司），HR 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗、DAB 顯影液（上海碧云天生物技術(shù)研究所），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），酶標(biāo)儀、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（上海Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染

HT29 細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在5%二氧化碳CO2，37.0 ℃條件孵育箱中 培 養(yǎng)。ADAM17 小 干 擾RNA（ADAM17-shRNA） 由上海吉瑪公司合成，序列如下：轉(zhuǎn)染組，5'-GCATCAT GTATCTGAACAACG-3'；無意義序列組，5'-TTCTCCG AACGTGTCACGT-3'。

HT-29 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染組（ADAM17-shRNA）和無意義序列組（nonsense shRNA）根據(jù)使用說明書在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時加入5 μg/ml 聚凝胺（Polybrene）?？瞻讓φ战M加入等量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），轉(zhuǎn)染后48 h 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3 慢病毒沉默ADAM17 表達(dá)的檢測

根據(jù)病毒轉(zhuǎn)染說明書，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞，Trizol 法提取RNA。通過Go ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）。引物序列設(shè)計如下：ADAM17 正向引物：5'-ATCAAACCTTTCCTG CG-3'，反向引物：5'-CAAACCCATCCTCGTCCA-3'；GAPDH正向引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。

PCR 儀器進(jìn)行以下循環(huán)：95℃變性2 min，45℃退火30 s，60℃延伸60 s，共40 個循環(huán)。根據(jù)qRTPCR 體系參照GAPDH 做為內(nèi)參的表達(dá)水平來檢測HT29 結(jié)腸癌細(xì)胞的ADAM17 mRNA 表達(dá)水平。每組設(shè)2 個副孔，平行實驗3 次。采用相對定量法（CT 法）分析所得數(shù)據(jù)，ADAM17 shRNA 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞mRNA 相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測

利用單層細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)實驗檢測細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，HT29 細(xì)胞在對數(shù)生長階段制備成單細(xì)胞懸液，按照轉(zhuǎn)染組、無意義序列組和空白對照組以每孔1×105個接種于6 孔板上，培養(yǎng)12 h使形成單層細(xì)胞。用200 μl 移液槍槍頭在單層細(xì)胞上水平劃出一道痕跡，用PBS 清洗3 次，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基 37℃培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。Image J 軟件分析遷移面積。實驗均重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.5 Transwell 體外侵襲實驗

通過觀察穿過Matrigel 膠的細(xì)胞數(shù)量檢測不同處理對于結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。HT29 細(xì)胞在對數(shù)生長階段用不含有FBS 的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，以同步化細(xì)胞，然后制備成細(xì)胞懸液。將Matrigel 膠與DMEM 按照1 ∶8 稀釋，取出70 μl 覆蓋在Transwell小室底部膜的上室面，置于37℃下30 min，使Matrigel聚合成凝膠。按照空白對照組，無意義序列組和轉(zhuǎn)染組以每孔1×104個，體積為200 μl 的細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室的上室。下室加入750 μl 含F(xiàn)BS的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去掉上室的Matrigel 膠，4%甲醛固定液中30 min，蘇木精-伊紅染色1 min 后PBS 沖洗3 次，顯微鏡下隨機(jī)選取3 個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。重復(fù)進(jìn)行3 次獨(dú)立操作加以驗證。

1.6 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后48 h 各組細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解，離心收集蛋白。BCA 法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳，再分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（90 V，90 min），10%脫脂奶封閉，一抗孵育過夜（1 ∶1 000），二抗（1 ∶1 000）37℃孵育2 h，上機(jī)熒光顯色。Image J 軟件分析灰度值。相關(guān)蛋白表達(dá)量計算=（所測蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17-shRNA 轉(zhuǎn)染HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞情況

轉(zhuǎn)染效率為90%以上的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）值為100，體外轉(zhuǎn)染48h，熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)判斷轉(zhuǎn)染情況，可見轉(zhuǎn)染效率90%以上。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后ADAM17 的表達(dá)情況

空白對照組mRNA 表達(dá)量分析系統(tǒng)設(shè)定恒定為1，轉(zhuǎn)染組相對表達(dá)量為（0.104±0.013），無意義序列組為（1.003±0.036），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1649.515，P=0.000），轉(zhuǎn)染組ADAM17 mRNA 的表達(dá)被抑制且低于空白對照組和無意義序列組（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和無意義序列組ADAM17 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Western blotting 結(jié)果同樣證實慢病毒轉(zhuǎn)染后ADAM17 表達(dá)被抑制。見圖2。

2.3 單層細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)情況

24 h 后，空白對照組（0.646±0.022）、無意義序列組（0.671±0.027）和轉(zhuǎn)染組（0.986±0.032）的劃痕間距相對比，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 10.176，P=0.012），沉默ADAM17 后HT29 細(xì)胞的遷移速度均慢于空白對照組和無意義序列組的細(xì)胞（P＜0.05），空白對照組和無意義序列組的細(xì)胞遷移能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染ADAM17 后細(xì)胞體外侵襲能力變化情況

空白對照組和無意義序列組可觀察到穿過Matrigel 膠到達(dá)下室的腫瘤細(xì)胞多于轉(zhuǎn)染組。各組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（151.004±5.025）、（147.113± 6.333）及（52.002±5.196）個/視野。經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=136.936，P=0.000），與空白對照組比較，無意義序列組到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但與空白對照組和無意義序列組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞到達(dá)下室的HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)量減少很多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖1 ADAM17 慢病毒轉(zhuǎn)染HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞48 h 后的轉(zhuǎn)染情況 （×200）

圖2 轉(zhuǎn)染后各組ADAM17 mRNA 及ADAM17 蛋白表達(dá)情況

圖3 沉默ADAM17 后HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力變化情況 （×100）

圖4 沉默ADAM17 后HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力變化情況 （×100）

2.5 沉默ADAM17 后MMP-9，ERK 表達(dá)情況

沉默ADAM17 蛋白表達(dá)后，空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組MMP-9 的表達(dá)分別為（0.903± 0.104）、（0.878±0.121）及（0.151±0.102），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.172，P=0.000），進(jìn)一步檢測ERK1/2 通路，結(jié)果顯示，p-ERK1/2 表達(dá)同樣發(fā)生下調(diào)，空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組p-ERK1/2 的表達(dá)分別為（0.656±0.141）、（0.647± 0.133）和（0.333±0.102），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.130，P=0.035）。沉默ADAM17 后，轉(zhuǎn)染組MMP9 和p-ERK1/2 的表達(dá)均低于空白對照組和無意義序列組（P＜0.05），空白對照組和無意義序列組的MMP9 和p-ERK1/2 的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 沉默ADAM17 后MMP-9 和ERK1/2 蛋白的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是一種由遺傳、飲食、環(huán)境、習(xí)慣等多因素共同作用的腸道惡性腫瘤[6]，近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，膳食纖維等攝入減少，結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[1]。由于缺乏相關(guān)預(yù)防保健知識，我國大多數(shù)結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于疾病中晚期。目前，對結(jié)腸癌的治療依然是以手術(shù)切除為主，輔以同步放化療及靶向治療和生物治療。但是人們現(xiàn)在的目光越來越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治療上[7]。

ADAM17 是一種具有蛋白水解，活化配體，釋放生物活性因子功能的前體蛋白[8]。研究報道指出，ADAM17 在胃癌，乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)狀態(tài)[5，9]。同樣，也有報道指出，ADAM17 在結(jié)腸癌組織中也呈異常高表達(dá)狀態(tài)，并且，這種高表達(dá)狀態(tài)與患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。有研究報道指出，ADAM17 可以通過激活EGFR/MEK/ERK 通路調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為[12]。

不斷發(fā)生的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部組織侵襲是腫瘤惡性病因的原因之一，也是腫瘤患者治療失敗甚至死亡的原因之一。因此，阻止腫瘤的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和局部繼續(xù)浸潤是目前許多腫瘤藥物的研究重點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力的前提條件是對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMP-9 被證實在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。并且MMP-9 的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈正相關(guān)[14-15]。MMP-9 可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)使細(xì)胞穿透[16]。同時，MMP-9 的活化依賴于ERK 信號通路的激活[17]。在本實驗中，在沉默ADAM17 的表達(dá)后，MMP-9 的表達(dá)被下調(diào)，說明沉默ADAM17 可以通過下調(diào)MMP-9 的表達(dá)，從而影響HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。

ERK 是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵基因，包括ERK1 和ERK2，在受激活磷酸化后，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和功能，并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[18]。p-ERK1/2 可以作用于多種細(xì)胞內(nèi)因子最終促使癌基因的表達(dá)。各種外界的不同刺激以及不同強(qiáng)度的刺激都可以促使ERK1/2 不同程度的激活，在細(xì)胞遷移和黏附中發(fā)揮重要作用，從而增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動和黏附能力[19]，促使細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中移動[20-21]。在本實驗中，進(jìn)一步檢測ERK 信號通路發(fā)現(xiàn)，沉默ADAM17 后，p-ERK1/2的表達(dá)被下調(diào)，說明沉默ADAM17 可以降低ERK1/2信號通路的激活。

本研究結(jié)果顯示，ADAM17 能夠通過ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控MMP-9 的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移侵襲能力，實現(xiàn)對HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖遷移侵襲調(diào)控的作用，但ERK 通路可能不是其調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的唯一信號通路，其對細(xì)胞行為功能的響和具體作用機(jī)制需后續(xù)實驗進(jìn)一步探究。