李亞莉 董艷輝 侯麗媛 聶園軍 任永康 王育川 吳新明

（1山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，太原030031；2山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，太原030006；3山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，太原030031；4新疆生產(chǎn)建設兵團第六師農(nóng)業(yè)科學研究所，五家渠831300）

小麥作為全球的主要糧食，是種植范圍最廣的作物之一，但小麥品種遺傳基礎狹窄、遺傳差異小，嚴重制約了小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的進一步提高。小麥近緣屬種中具有許多改良小麥所需的優(yōu)良基因，通過遠緣雜交或其他手段將這些優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←?，著力挖掘和利用小麥野生近緣種屬的重要基因，是拓寬中國小麥育成品種的遺傳基礎和進行小麥遺傳改良的重要途徑[1-3]。

十倍體長穗偃麥草（Thinopyrum ponticum）是小麥族近緣多年生物種，具有生長繁茂、多花多實，抗條銹病、葉銹病、黑穗病和白粉病，抗寒冷、耐干旱等優(yōu)良性狀[4-7]；中間偃麥草（Thinopyrum intermedium）具有許多可供小麥育種利用的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，如耐寒、耐旱、抗真菌病和病毒病等[8-10]；硬粒小麥（Triticum turgidum L． ssp． durum，AABB）是栽培的四倍體小麥，是加工通心粉的優(yōu)質(zhì)專用小麥，富含賴氨酸和類胡蘿卜素，具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)，在歐洲許多國家及美洲、北非和中東地區(qū)很受歡迎[11-13]。本研究通過八倍體小偃麥和四倍體硬粒小麥雜交，創(chuàng)制同時含有偃麥草和硬粒小麥優(yōu)異基因片段的育種中間材料，為小麥育種實踐和生產(chǎn)提供更豐富的遺傳資源；同時結(jié)合FISH、GISH、Mc-GISH技術(shù)分析，篩選后代材料，為深入研究外源染色體在小麥背景中的傳遞機制提供細胞學遺傳依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗材料為八倍體小偃麥和四倍體硬粒小麥的雜交后代。其中，八倍體小偃麥有山農(nóng)20（十倍體長穗偃麥草和小麥的雜交后代）、中3和中4（中間偃麥草和小麥的雜交后代），試驗材料由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所韓方普研究員提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 中期染色體的制備 根尖細胞中期染色體的制備、探針標記方法以及原位雜交程序均按照 Han等[14]的方法進行。每份材料分別選取約20粒籽粒飽滿的種子，將挑選好的種子置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待根長長到2～3cm時，剪取生長旺盛的根尖放在37℃的果膠酶和纖維素酶混合溶液中消化50min，然后用70%的酒精洗2次，搗碎，離心，再用100%的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位雜交技術(shù) 植物總DNA的提取采用CTAB法[15]，利用微量紫外分光光度計檢測樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋至終濃度為100ng/μL。原位雜交程序按照Han等[14]的方法進行，在GISH分析中，提取中間偃麥草的基因組DNA，用fluorescein-12-dUTP標記，小麥的著絲粒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子用Texas red-5-dCTP標記，用中國春基因組DNA作封阻；在 FISH 分析中，pAs1探針的信號標記，pSc119．2探針的信號標記；在Mc-GISH分析中，提取長穗（中間）偃麥草的基因組DNA，用fluorescein-12-dUTP標記，B基因組作封阻。細胞學鏡檢采用OLYMPUSBX60熒光顯微鏡觀察，用Photo-metrics SenSys CCD成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 山農(nóng)20和四倍體硬粒小麥雜交后代材料的細胞學特征 遠緣雜交可以將近緣種屬中的優(yōu)異基因?qū)肫胀ㄐ←溨?，應用Mc-GISH的基因組原位雜交技術(shù)檢測，統(tǒng)計分析小麥染色體A組、B組和D組的染色體數(shù)目及十倍體長穗偃麥草染色體的數(shù)目。由圖1可知，在被檢測的后代材料中，未發(fā)現(xiàn)A組和B組（28條染色體）的后代材料，染色體數(shù)量穩(wěn)定在40～44之間的材料較多；所有材料中均含有D組染色體10～14條，十倍體長穗偃麥草染色體0～14條，D組大部分材料染色體優(yōu)先穩(wěn)定在12～14條，而十倍體長穗偃麥草染色體則0～14條不等，可見小麥D組染色體優(yōu)先傳遞到后代籽粒中。

圖1 小麥D組染色體和十倍體長穗偃麥草染色體在總?cè)旧w數(shù)中的變化規(guī)律

進一步分析發(fā)現(xiàn)，山農(nóng)20和四倍體硬粒小麥雜交后代材料2572、2578號個體中沒有發(fā)現(xiàn)十倍體長穗偃麥草染色體（圖2A、B）；在后代材料2591號個體中發(fā)現(xiàn)了多條附加十倍體長穗偃麥草染色體（圖2C），且箭頭所指處有染色體斷裂和易位的現(xiàn)象。

圖2 雜交后代材料根尖中期細胞染色體的Mc-GISH分析

2.2 中3、中4和四倍體硬粒小麥雜交后代材料的細胞學特征 材料創(chuàng)制過程中，將中3、中4和四倍體硬粒小麥雜交創(chuàng)制育種中間材料，使其集合多個屬的優(yōu)異基因。由圖3所示，在被檢測的后代材料中，發(fā)現(xiàn)少數(shù)A組、B組（含28條染色體）的后代材料；大部分被檢測的材料均含有D組染色體1～14條，中間偃麥草染色體1～14條，沒有發(fā)現(xiàn)小麥D組染色體較中間偃麥草染色體優(yōu)先傳遞的規(guī)律，即小麥D組染色體和中間偃麥草染色體隨機進入后代籽粒中。

圖3 小麥D組染色體和中間偃麥草染色體在總?cè)旧w數(shù)中的變化規(guī)律

進一步分析發(fā)現(xiàn)，中3、中4和四倍體硬粒小麥雜交后代材料2469號個體中只有小麥A、B組染色體，共28條（圖4A）；在后代材料2478號個體中發(fā)現(xiàn)了12條附加中間偃麥草染色體（圖4B），且箭頭所指處有染色體易位的現(xiàn)象。

圖4 雜交后代材料的根尖中期細胞染色體的GISH和Mc-GISH分析

2.3 2576-1代換系抗條銹病鑒定結(jié)果 從約190份后代材料中篩選出3份穩(wěn)定的代換系，應用GISH技術(shù)對其中的2576-1代換系分析發(fā)現(xiàn)，個體染色體總數(shù)為42條，其中有2條十倍體長穗偃麥草染色體（圖5A箭頭所示）；應用FISH技術(shù)檢測并對染色體進行核型分析發(fā)現(xiàn)，有2條十倍體長穗偃麥草染色體代換了小麥的1D染色體（圖5C）；圖5D、E是對新代換系2576-1抗條銹病檢測結(jié)果，圖5E中的箭頭所示是用生理小種M169侵染后，2576-1代換系出現(xiàn)壞死而未發(fā)現(xiàn)菌斑，表明該代換系具有抗條銹病的特性。下一步還將繼續(xù)開展其他的抗病性檢測，明確該材料在育種中的應用價值。

3 結(jié)論與討論

在小麥遠緣雜交育種研究中，為了明確遠緣雜交后代外源染色體的傳遞率，從而有效提高其選擇率，從單條外源染色體到多條或整套外源染色體在小麥背景中的傳遞研究不斷增多[16-18]。其中，在小麥的遠緣雜交育種中，由于偃麥草屬和硬粒小麥的染色體傳遞率較高，育種家經(jīng)常應用不同種屬之間的非等倍體雜交創(chuàng)制附加系、代換系等育種中間材料，將近緣種屬的優(yōu)異基因?qū)肫胀ㄐ←溨衃19-21]。

圖5 2576-1代換系的染色體核型分析和抗性檢測

本研究中，應用原位雜交技術(shù)檢測八倍體小偃麥和硬粒小麥雜交后代材料染色體的組成情況。山農(nóng)20和四倍體硬粒小麥雜交后代籽粒較大，染色體數(shù)量穩(wěn)定在40～44之間的材料較多，小麥D組染色體組優(yōu)先傳遞；而中3、中4和四倍體硬粒小麥的雜交后代中，結(jié)實率不高，后代籽粒皺縮、偏小，小麥D組和中間偃麥草的染色體隨機進入雜交后代中；在所有的后代材料中篩選出3份單株性狀、籽粒性狀好，染色體穩(wěn)定在40～44之間的代換系，并對其中的2576-1代換系進行抗病性檢測，初步鑒定為抗條銹病，下一步將進行其他抗性檢測以明確該材料的育種價值。