郭 娟 李永杰 梁寧生

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院藥學部，南寧市 530021，電子郵箱：1599168279@qq.com)

細菌耐藥問題日趨嚴重，不僅危害人類健康，還給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。在歐盟國家，每年因耐藥菌感染引起的死亡數(shù)超過25 000人，費用總計超過9億歐元；在美國，每年因耐藥菌感染引起的死亡數(shù)約有23 000人，醫(yī)療費用達260億美元[1]。開發(fā)新型抗菌藥物以有效對抗耐藥菌是解決耐藥菌感染的方法之一。抗菌肽最初是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類具有抗菌活性的小分子多肽，后來出現(xiàn)人工合成的抗菌肽，它們具有分子量小、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、作用機理獨特等優(yōu)點[2]，有望成為新型高效抗菌藥物，從而解決耐藥菌問題。目前，有幾種人工合成的抗菌肽已進入臨床試驗階段，用于局部和全身感染的治療。Pexiganan是一種含有22個氨基酸的magainin-2類似物，是第一種用于糖尿病足潰瘍局部治療的抗菌肽[3]。

人ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)，也稱為血小板型PLA2，是哺乳動物重要的抗菌蛋白之一，在宿主防御細菌感染方面發(fā)揮重要的作用[4]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)ⅡA 型PLA2對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有殺菌作用[5]，并且根據(jù)其C-末端及N-末端分別衍生合成的多肽也都具有殺菌活性[6-7]。本研究根據(jù)ⅡA型PLA2的N末端15個氨基酸序列合成多肽，并以此多肽為模板，改變不同位置的氨基酸，最終合成6種衍生肽；比較模板肽ⅡA型PLA2N端15肽(PLA2-N15)及6種衍生肽的殺菌活性，進而分析多肽分子結構與殺菌活性間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細菌標準株：革蘭陰性菌大腸埃希菌ATCC 44113以及革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC 26003均由廣西醫(yī)科大學微生物學教研室提供，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 實驗藥品與試劑：模板肽PLA2-N15(批號:pep16080425)及其6種衍生肽PLA2-H6R(批號:pep16080426)、PLA2-H6R-T12R(批號:pep16080429)、PLA2-H6R-T12V(批號:pep16040509)、PLA2-N4R-H6R(批號:pep16080428)、PLA2-N4R-H6R-T13R(批號:pep16080430)、PLA2-N1A-H6R-T12L(批號:pep16080427)均由本課題組設計經(jīng)上海波泰有限公司合成，純度均為90%；1%小牛血清白蛋白(V/W)(批號:323N057)由北京索萊寶科技有限公司提供；RPMI-1640(批號:0025316)培養(yǎng)基由Biological Industries公司提供；無水氯化鈣(批號:10043-52-4)由成都市科隆化工試劑廠提供；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(純度≥99%，批號:513C0412)由北京索萊寶科技有限公司提供；LB營養(yǎng)瓊脂(批號:170206)由北京路橋技術有限責任公司提供；LB培養(yǎng)基粉(批號:A507007-0205)由生工生物工程股份有限公司(上海)提供。

1.1.3 實驗儀器： (1)DRP-9272型恒溫培養(yǎng)箱(上海森信儀器有限公司)；(2)AnkeTGL-16C型離心機(上海安亭科技儀器廠)；(3)Thermo MAXQ8000型恒溫搖床(Thermo Scientific Electron公司)；(4)UV756型分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；(5)DK-914型恒溫水浴鍋(上海森信儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多肽的設計與合成：查詢NCBI網(wǎng)站的基因庫，獲取人ⅡA型PLA2蛋白質(zhì)N末端第1～15個氨基酸序列NLVNFHRMIKLTTGK (N為天冬酰胺，L為亮氨酸，V為纈氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，H為組氨酸，R為精氨酸，M為甲硫氨酸，I為異亮氨酸，K為賴氨酸，T為蘇氨酸，G為甘氨酸)。以上述氨基酸序列為模板合成PLA2-N15及其衍生肽。(1)PLA2-H6R，第6位的H替換為R；(2)PLA2-H6R-T12R，第6位的H替換為R、第12位的T替換為R；(3)PLA2-H6R-T12V，第6位的H替換為R、第12位的T替換為V；(4)PLA2-N4R-H6R，第4位的N替換為R、第6位的H替換為R； (5)PLA2-N4R-H6R-T13R，第4位的N替換為R、第6位的H替換為R、第13位的T替換為R；(6)PLA2-N1A-H6R-T12L，首位的N替換為A、第6位的H替換為R、第12位的T替換為L。見表1。

表1 PLA2-N15及其衍生肽的一級結構及結構改變特點

注：下劃線標注者代表被替換的氨基酸。

1.2.2 多肽的配制與保存：將PLA2-N15及其6種衍生肽分別溶于400 μl滅菌的雙蒸水中，配制成濃度為10 g/L的多肽母液，以20 μl/管分裝于EP管中，-20℃冷凍保存，根據(jù)實驗需要取用，避免反復凍融。

1.2.3 殺菌活性的測定：采用瓊脂鋪板計數(shù)法[8]測定多肽殺菌活性。(1)細菌培養(yǎng)及菌液制備。取過夜培養(yǎng)的細菌，按1 ∶50的比例加入3 ml新鮮的LB培養(yǎng)液中，置于37℃的恒溫搖床孵育2.5 h，達對數(shù)生長期。室溫下1 000 r/min離心45 s后收集細菌，用生理鹽水洗滌細菌并再次離心，棄上清液，將所得細菌沉淀物重懸于500 μl生理鹽水并混勻，于紫外分光光度計的540 nm波長處測定吸光度值，記錄吸光度值達0.1時所需的細菌量(μl)，計算細菌的稀釋倍數(shù)，并將細菌稀釋至每毫升1×107菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)備用。(2)配制細菌孵育體系。取過濾后的RPMI-1640液900 μl，加入50 μl小牛血清白蛋白(1%)、20 μl 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、20 μl氯化鈣(1 mmol/L)，配制成pH≈7.40的反應體系。(3)實驗分組。將每條衍生肽分為對照組和4個實驗組(衍生肽終濃度分別為8、40、200、1 000 μg/ml)，取80 μl反應體系，各實驗組加10 μl菌液和10 μl相應終濃度的衍生肽，對照組加入10 μl菌液和等體積的生理鹽水?；靹蚝笾糜?7℃恒溫水浴2 h。(4)計算殺菌率。2 h后從上述各反應體系中取出反應液40 μl，加入360 μl滅菌生理鹽水中，連續(xù)10倍稀釋，共稀釋5次，取100 μl稀釋液于無菌培養(yǎng)皿(直徑約55 mm)中，加入滅菌的LB營養(yǎng)瓊脂6 ml搖勻，待瓊脂凝固后，放入37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)18～24 h。計數(shù)瓊脂板上的CFU，取CFU為30～300之間的瓊脂板進行計數(shù)。計算衍生肽作用后的殺菌率(%)，殺菌率=(對照組CFU-實驗組CFU)/對照組CFU×100%。每組實驗重復5次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對革蘭陽性菌的殺菌率比較 多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時，6種衍生肽的殺菌率均高于PLA2-N15(均P<0.05)；任一濃度下PLA2-H6R-T12V與PLA2-N1A-H6R-T12L的殺菌率均高于PLA2-N15及其他4種衍生肽(均P<0.05)；多肽濃度為8 μg/ml、40 μg/ml時，PLA2-H6R-T12V的殺菌率均高于PLA2-N1A-H6R-T12L(均P<0.05)。見表2。

表2 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對革蘭陽性菌的殺菌率比較(x±s，%)

注：與PLA2-N15比較，aP<0.05；與PLA2-H6R比較，bP<0.05；與PLA2-H6R-T12V比較，cP<0.05；與PLA2-N1A-H6R-T12L比較，dP<0.05。

2.2 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對革蘭陰性菌的殺菌率比較 多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時，除PLA2-H6R外，其他5種衍生肽的殺菌率均高于PLA2-N15(均P<0.05)；多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時，PLA2-H6R-T12V與PLA2-N1A-H6R-T12L的殺菌率均高于其他4種衍生肽(均P<0.05)；多肽濃度為40 μg/ml時，PLA2-H6R-T12V的殺菌率低于PLA2-N1A-H6R-T12L(P<0.05)。見表3。

表3 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對革蘭陰性菌的殺菌率比較(x±s,%)

注：與PLA2-N15比較，aP<0.05；與PLA2-H6R比較，bP<0.05；與PLA2-H6R-T12V比較，cP<0.05；與PLA2-N1A-H6R-T12L比較，dP<0.05。

3 討 論

3.1 PLA2-N15及其衍生肽的設計 利用美國NCBI網(wǎng)站的基因庫，查詢目前能夠獲取的所有哺乳類生物ⅡA型PLA2的N末端15個氨基酸殘基序列，包括人、猩猩、猴、兔、牛、豚鼠、大鼠、小鼠共8種生物，其氨基酸殘基序列如圖1所示。對8種生物氨基酸序列的構成情況進行對比發(fā)現(xiàn)，不同物種第5、8、9、13、14、15位的氨基酸完全一致，其他位置上則存在差別。前期研究表明，多肽分子的酸堿性和疏水性對其殺菌活性有重要影響[9]，但不同的肽分子其殺菌活性又有所不同。故我們在ⅡA型PLA2的N末端15個氨基酸殘基序列多肽分子中對不同位置的酸堿性和疏水性氨基酸進行改造，并分析其殺菌活性。考慮到高度保守的氨基酸對分子結構可能起到關鍵作用，我們在設計衍生肽時不改變其高度保守的氨基酸；同時，不同物種ⅡA型PLA2的N末端氨基酸序列的第2位氨基酸種類雖不同，但性質(zhì)相同，都是疏水性氨基酸，故也不作改變，最終選擇第1、4、6、12、13位氨基酸進行改造。

圖1 8種哺乳類生物ⅡA型PLA2N末端15個氨基酸殘基構成情況

注：上排數(shù)字(1～15)代表多肽一級結構的氨基酸順序；下排數(shù)字代表氨基酸取代次數(shù)(與人ⅡA型PLA2N末端15個氨基酸殘基相同位置比較)。

3.2 PLA2-N15及其衍生肽的分子結構與殺菌活性的關系

3.2.1 多肽的殺菌作用與疏水性氨基酸的關系：任一濃度下，PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L對革蘭陽性菌的殺菌率高于其他多肽，在200 μg/ml和1 000 μg/ml下對革蘭陰性菌的殺菌率高于其他多肽(P<0.05)。提示7種多肽中殺菌作用最強的是多肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L。分析其結構發(fā)現(xiàn)，與PLA2-N15相比，多肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L都增加了疏水性氨基酸，疏水性氨基酸比例由0.467分別上升至0.533和0.600，提示適度增加疏水性氨基酸比例可明顯增強殺菌活性。Yin等[10]的研究結果也顯示，增加抗菌肽疏水性在一定程度上可改善殺菌活性[11]。同時，當多肽濃度小于200 μg/ml時，PLA2-N1A-H6R-T12L對革蘭陽性菌的殺菌活性低于PLA2-H6R-T12V(P<0.05)，可能與其將首位親水性氨基酸N替換為疏水性氨基酸A有關，提示首位為親水性氨基酸對于提高ⅡA型PLA2N端肽對革蘭陽性菌的殺菌活性更為重要，這點不同于Ⅰ型PLA2[11]。對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性，多肽PLA2-N1A-H6R-T12L均明顯強于PLA2-H6R-T12R，分析結構發(fā)現(xiàn)，前者同時增加堿性氨基酸和疏水性氨基酸比例，而后者僅增加堿性氨基酸，提示適當增加疏水性氨基酸比例能更有效地提高多肽的抗菌活性。與PLA2-N15相比，衍生肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性均增強，這可能與它們的疏水性結構更易于與細菌表面結合有關。進一步分析其結構特點，將為今后抗菌肽新藥的開發(fā)與應用提供新依據(jù)。

3.2.2 多肽殺菌作用與堿性氨基酸的關系：多數(shù)學者認為，抗菌肽是通過損傷細菌細胞膜來發(fā)揮殺菌作用的[12]。而抗菌肽發(fā)揮殺菌作用的重要結構基礎是堿性氨基酸，可使抗菌肽分子帶正電荷，并與帶負電荷的細菌膜表面相結合，進而導致細菌裂解死亡而起到滅菌作用[13]。Malmsten等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，增加抗菌肽分子正電荷數(shù)，其抗菌活性也隨之增強。本研究結果顯示，PLA2-N15及其6種衍生肽在一定濃度下對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有殺菌作用，且多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時，6種衍生肽的殺菌作用均強于PLA2-N15。其中，與PLA2-N15相比，多肽PLA2-H6R將弱堿性氨基酸(H)替換為強堿性氨基酸(R)，凈正電荷未增加，其殺菌活性弱于PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L；多肽PLA2-N4R-H6R、PLA2-H6R-T12R和PLA2-N4R-H6R-T13R除了將弱堿性氨基酸(H)替換為強堿性氨基酸(R)，還將中性氨基酸(N或T)替換為堿性氨基酸(R)，凈正電荷數(shù)由+4分別增加至+5、+5和+6，多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時，其對革蘭陰性菌的殺菌活性較PLA2-N15、PLA2-H6R均增強，同時，PLA2-H4R-H6R(1 000 g/ml時)、PLA2-H6R-T12R(200 g/ml時)和PLA2-N4R-H6R-T13R(除8 g/ml外)對革蘭陽性菌的殺菌活性均強于PLA2-H6R，且三種衍生肽對革蘭陽性菌的殺菌作用均強于PLA2-N15(除8 g/ml外)，提示增加凈正電荷有助于增強其殺菌活性，這與我們前期的研究結果類似[15]，但其殺菌效果仍弱于PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L，可能與后兩種多肽結構中均包含有4個堿性氨基酸以及凈正電荷數(shù)只增加到+4有關。這是因為模板15肽含有4個正電荷，已經(jīng)屬于堿性較強的分子，進一步增加凈正電荷數(shù)，使抗菌肽與細菌膜結合牢固，反而影響其穿膜效率，最終導致抗菌肽殺菌活性降低[16]。

綜上所述，人ⅡA型PLA2N端衍生肽的殺菌活性與其疏水性氨基酸比例及位置、氨基酸的酸堿性密切相關，適當?shù)奈恢迷黾邮杷园被峄驂A性氨基酸，在一定程度上可增強衍生肽的殺菌活性，且將衍生肽第12位氨基酸替換為疏水性氨基酸時殺菌活性最強，這或可為今后開發(fā)新的抗菌藥物提供新思路。