羅秀梅，劉競麗，王偉，李東斌，覃武，李鳳梅，周振華

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，廣西 南寧 530021）

短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack,TIA）是臨床中較為常見的一種缺血性腦血管病，其發(fā)作時持續(xù)時間為數(shù)分鐘到1 h，在24 h之內(nèi)神經(jīng)功能能夠完全恢復(fù)[1]。微小RNA（microRNA,miRNA）是由20個-24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，有研究表示miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟發(fā)育和多項神經(jīng)生理過程，起關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]。

在本次研究中，我們通過模擬短暫性腦缺血發(fā)作，再通過q RT-PCR技術(shù)篩檢測血漿中外泌體源性miR-22-5p表達趨勢，并探討其作為生物標志物潛在價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 實驗動物選擇的為成年健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量為（260±20）g，購買于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。將20只SD大鼠隨機分為了假手術(shù)組、缺血造模組（缺血5 min組、10 min組、2 h組），每組各5只大鼠。整個動物實驗過程中，動物的處理均符合動物倫理學標準。

1.2 SD大鼠大腦中動脈栓塞模型的制備 SD大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞模型。步驟如下：用 10%的水合氯醛對大鼠通過腹腔注射進行麻醉，沿頸正中線切開1 cm-2 cm長的切口，輕柔的暴露右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。用縫線結(jié)扎頸總動脈遠心端、頸外動脈，然后在頸總動脈剪開一小口，緩慢插入線栓，深度約為18 mm，用縫線固定線栓，剪去線栓尾部。假手術(shù)組的大鼠，只需要暴露和分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈即可，不需要插入線栓。

1.3 血漿樣本的采集 分別抽取假手術(shù)組，大腦中動脈栓塞后5 min、10 min、2 h的大鼠動脈血樣本。

1.4 HE染色 將大鼠腦組織載玻片復(fù)溫30 min后脫蠟再放在不同濃度乙醇中進行脫水，之后放入蘇木素染液。沖洗玻片后放0.5%的伊紅染液進行染色。沖洗后再脫水。最后將玻片放入二甲苯溶液中3 min后，取出烘干，用中性樹脂封片。HE染色完成后，使用顯微鏡（100×）觀察切片，以評估神經(jīng)細胞的受損程度。

1.5 外泌體的分離 按照exo RNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書提取大鼠血漿外泌體。

1.6 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 大鼠血漿外泌體樣本解凍并混勻后取10 μL外泌體懸液滴于硬紙板上，200目銅網(wǎng)覆蓋1 min，再用1%醋酸雙氧鈾負染15 s，室溫晾干。銅網(wǎng)然后將安裝在透射電鏡上觀察外泌體的形態(tài)并拍照。

1.7 血漿外泌體源性RNA提取 使用mi RNeasy?Serum/Plasma kit提取外泌體源性總 RNA。血漿外泌體解凍后，轉(zhuǎn)移到離心柱并700 μL的QIAzol 溶液，5,000g，室溫離心5 min。將溶解液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，室溫下孵育5 min。然后加入90 μL氯仿，混勻后室溫孵育3 min，12,000 g，4oC離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移新的EP管中，按2倍體積的100%乙醇加入EP管中并混勻。吸取混合液體轉(zhuǎn)移至離心柱中，8,000g，室溫離心15 s丟棄濾液。按相同步驟將剩下的液體加入離心柱內(nèi)離心后丟棄過濾液。然后將Buffer RWT溶液加入離心柱中，8,000g，室溫離心15 s，丟棄濾液。繼續(xù)加Buffer RPE溶液，8,000g，室溫離心15 s丟棄濾液，重復(fù)上一步驟。離心干燥柱膜后，換新的EP管后，將10 μL的RNase-free水滴在離心柱的膜中央，15,000g，室溫離心1 min。EP管中的濾液即為RNA樣品。

圖1 A：血漿外泌體mi-22-5p在假手術(shù)組及缺血各組中的相對表達水平（＊P＜0.05）；B：血漿外泌體源性mi-22-5p在大鼠中的診斷價值：缺血5 min，mi-22-5p表達量的ROC曲線下面積AUC=0.880。

1.8 q RT-PCR外泌體源性RNA的表達量 將提取的血漿外泌體源性RNA按Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進行逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。然后使用實時熒光定量PCR檢測血漿外泌體源性miR-22-5p的表達量。

1.9 統(tǒng)計學分析 將數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。用平均值±標準差（Mean±SD）表示計算結(jié)果，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義；用ROC曲線評估血漿外泌體源性miRNA在短暫性腦缺血發(fā)作中的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 在顯微鏡下觀察假手術(shù)組腦組織的切片，可以看見腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)完整；而造模后，缺血5 min組的腦組織切片可見少量神經(jīng)細胞壞死和水腫；缺血10 min組，可見細胞核固縮，深染，數(shù)量較缺血5 min組增加，細胞排列紊亂；缺血2 h組，鏡下可見神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡化、纖維破碎溶解，大量神經(jīng)元壞死。

2.2 血漿外泌體源性rno-miR-22-5p的相對表達水平 與假手術(shù)組，血漿外泌體源性rno-miR-22-5p在缺血5 min、10 min組中表達水平呈上調(diào)趨勢，表達量有明顯差異且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而缺血5 min、10 min組與缺血2 h組對比，血漿外泌體源性rno-miR-22-5p在缺血2 h組中表達呈明顯下降趨勢（P＜0.05，圖1A）。

2.3 ROC 曲線預(yù)測血漿外泌體源性rno-miR-22-5的診斷價值 使用ROC曲線，評價血漿外泌體源性miR-22-5p缺血5 min和10 min的表達量對大鼠短暫性腦缺血發(fā)作的診斷價值。在腦缺血5 min組，miR-22-5p表達量的ROC曲線下面積AUC=0.880（圖1B）。結(jié)果顯示血漿外泌體源性rnomiR-22-5p對大鼠短暫性腦缺血發(fā)作有著很高的診斷價值。

3 討論

短暫性腦缺血發(fā)作屬于缺血性卒中的一種重要類型，多因腦部血管病變，使頸動脈或椎-基底動脈系統(tǒng)短暫性供血不足，導致局灶性腦缺血，從而產(chǎn)生短暫神經(jīng)功能障礙。目前影像學檢查可以提示腦組織缺血征象[3]，但影像學檢測得費用高，技術(shù)復(fù)雜及設(shè)備要求高無法普及。因此尋找容易普及而且能有效預(yù)測TIA發(fā)生發(fā)展的血液標志物，對腦卒中的防治具有重要意義。

外泌體具備雙膜結(jié)構(gòu)能，從而使miRNA不易降解，穩(wěn)定性高[4]。最近有研究表明，外泌體可通過血腦屏障轉(zhuǎn)移至體循環(huán)，提示血漿中外泌體所攜帶的miRNAs可能更真實地反映顱內(nèi)情況，具備作為短暫性腦缺血診斷生物標志物的潛力。在本次研究中，我們檢測血漿外泌體源性miR-22-5p是否能成為短暫性腦缺血的生物標志物。

首先，我們通過模擬短暫性腦缺血發(fā)作（缺血5 min、10 min）。使用qRT-PCR技術(shù)檢測其在血漿中rno-miR-22-5p的相對表達量。結(jié)果提示：與假手術(shù)組對比，缺血5 min和缺血10 min表達均升高，而缺血2 h時rno-miR-22-5p在血漿中的表達量降低。以上結(jié)果提示，與假手術(shù)組及缺血2 h對比，血漿外泌體源性rno-miR-22-5p在缺血5 min和10 min呈高表達，且表達差異有統(tǒng)計學意義，因此其有可能成為短暫性腦缺血的血液標志物。最后，為了對血漿外泌體源性rno-miR-22-5p的診斷價值進行評估，采用ROC曲線進行分析，通過分析發(fā)現(xiàn)在在短暫性缺血發(fā)作5 min時，血漿外泌體源性rno-miR-22-5p擁有較高的診斷價值（ROC曲線下面AUC=0.880）。

在我們的研究中，我們證明了miR-22-5p可能大腦缺血損傷有關(guān)，但對于miR-22-5p進一步研究和分析仍需進行。

本研究存在的局限性有：實驗樣本量較少；因時間有限，未對miR-22-5p進行生物信息學分析及功能驗證。

結(jié)論：血漿外泌體源性miRNA-22-5p有可能作為為大鼠短暫性腦缺血發(fā)作的一種潛在診斷生物標志物。