李麗梅 馮云霄 何近剛 程玉豆 關(guān)軍鋒

(河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051)

酚類物質(zhì)是果酒的“骨架成分”，是果酒的重要功能性成分，對(duì)果酒的口感和收斂性有決定性作用，同時(shí)影響著果酒的色澤、香氣以及抗氧化性[1]。梨是中國(guó)傳統(tǒng)種植水果，品種眾多，在大部分省份都有種植。梨酒是近年來(lái)梨加工制品的研究熱點(diǎn)，以鮮梨為原料，通過(guò)酵母菌發(fā)酵制成。目前關(guān)于梨酒的研究主要集中于生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[2-3]、釀酒酵母的分離篩選[4-5]、香氣成分的分析[2,6-7]、理化品質(zhì)分析[8-9]等方面，對(duì)梨酒中酚類物質(zhì)的分析研究尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。梨果實(shí)中含有酚類物質(zhì)，在梨酒釀制過(guò)程中被浸漬到酒中，賦予梨酒豐富的口感和營(yíng)養(yǎng)成分。梨[10-11]和葡萄[12]果實(shí)所含的酚類物質(zhì)不同，可能造成梨酒和葡萄酒[13-14]的酚類組成和含量不同，但目前尚未有關(guān)于梨酒中酚類物質(zhì)的含量和種類的報(bào)道。

本研究擬以鴨梨、雪梨、黃冠梨等11個(gè)品種梨為原料釀制梨酒，采用高效液相色譜法(HPLC)分析不同品種梨酒的酚類物質(zhì)種類和含量，以DPPH·清除率為指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗氧化性能，以期能從品種選擇、梨酒風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)等方面對(duì)梨酒的研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮梨：鴨梨、雪花、黃冠、雪青、早酥紅、紅香酥、南水、晚秀、南果、新高、秋月，于成熟期采摘于河北省趙縣范莊梨果種植基地，采收后入0 ℃貯藏；

甲醇、乙腈：色譜純，百靈威科技有限公司；

熊果苷、沒(méi)食子酸、綠原酸、(+)-兒茶素、槲皮素、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司；

咖啡酸、表兒茶素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；

3,4-二羥基苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥97.5%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；

商品化酵母菌株RC212：法國(guó)LAFFORT公司；

固相萃取小柱：Cleanert C18-SPE型，美國(guó)Agela Technologies公司；

高效液相色譜儀：HITACHI L-2000型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 梨酒釀制 取貯藏1個(gè)月的果實(shí)為材料進(jìn)行試驗(yàn)，將梨果實(shí)去皮切分榨取果汁，加入蔗糖調(diào)整果汁糖度至22 °Brix，接種市售商品化酵母菌株RC212，接種量為0.02%，進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵溫度22 ℃，待糖度不再下降時(shí)發(fā)酵結(jié)束，一般發(fā)酵10 d倒罐，靜置，自然澄清，得到不同品種梨釀制的梨酒。

1.2.2 酚類物質(zhì)分析 參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.3 抗氧化性性能評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[15]，DPPH·清除率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

S——DPPH·清除率，%；

A0—— DPPH· 甲醇溶液的吸光度；

Ai——樣品溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件JMP11.0(美國(guó)SAS公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 不同品種梨酒的酚類物質(zhì)種類和含量

參照酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(圖1)的出峰時(shí)間，在11個(gè)品種梨釀制的梨酒中共分離鑒定出10種酚類物質(zhì)，出峰時(shí)間依次是3，4-二羥基苯丙氨酸、熊果苷、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、蘆丁和槲皮素。圖2為酚類物質(zhì)含量適中、具有代表性的雪花梨酒的色譜圖。

由表1可知：

(1) 南果梨酒酚類物質(zhì)總量最高，為316.35 μg/mL，早酥紅、新高、雪青梨酒次之，分別為92.07，88.67，85.37 μg/mL，晚秀和雪花梨酒接近，分別是78.02，76.86 μg/mL，秋月和黃冠梨酒接近，分別是60.58，59.77 μg/mL，鴨梨、南水和紅香酥梨酒最低，分別為44.37，40.91，37.70 μg/mL。南果梨酒比較特別，不但其酚類物質(zhì)的總量最高，并且熊果苷、綠原酸、兒茶素、表兒茶素含量在11個(gè)品種梨酒中均最高。

1. 3,4-二羥基苯丙氨酸 2. 熊果苷 3. 沒(méi)食子酸 4. 原兒茶酸 5. 兒茶素 6. 綠原酸 7. 咖啡酸 8. 表兒茶素 9. 蘆丁 10. 槲皮素

圖1 10種酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

Figure 1 HPLC chromatogram of 10 kinds of phenolic standards

(2) 熊果苷在11個(gè)品種梨酒中含量均最高，占酚類物質(zhì)總量的37%～68%，變異系數(shù)為97.92%，其中在南果梨酒中含量最高，達(dá)到188.765 μg/mL，但所占比例并非最高。在南水梨酒中含量最低，僅為16.694 μg/mL，但所占比例并非最低。

(3) 兒茶素在鴨梨、雪梨、雪青、早酥紅和黃冠梨酒中含量排第二，在其他品種梨酒中含量排第三，其變異系數(shù)為71.18%，在南果梨酒中含量最高，為30.34 μg/mL，在紅香酥梨酒中含量最低，為1.14 μg/mL。

(4) 3,4-二羥基苯丙氨酸在南果梨、紅香酥、晚秀、南水和新高梨酒中含量排名第二，在其他品種梨酒中含量排第三。其變異系數(shù)為32.33%，在秋月梨酒中含量最高，為15.70 μg/mL，鴨梨酒中含量最低，為5.07 μg/mL。

(5) 綠原酸的變異系數(shù)最大為264.70%，僅在南果梨酒中含量高達(dá)66.17 μg/mL，僅次于熊果苷，排名第二；在雪梨酒中含量為5.61 μg/mL，在其他品種梨酒中則含量較低，不足3 μg/mL。

表1 不同品種梨酒的酚類物質(zhì)組成

(6) 表兒茶素的變異系數(shù)為131.31%，在南果梨酒中依然表現(xiàn)突出，含量高達(dá)14.557 μg/mL，在新高和秋月梨酒中含量分別為4.99，3.99 μg/mL；在其他品種梨酒中含量不足2 μg/mL。

(7) 沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁的含量在11個(gè)品種梨酒中均不足5 μg/mL，咖啡酸和槲皮素含量甚至不足2 μg/mL。原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸和蘆丁、槲皮素的變異系數(shù)為60%～80%，品種間差異明顯。3,4-二羥基苯丙氨酸和沒(méi)食子酸的變異系數(shù)分別是32.33%和34.61%，品種間有一定差異。

2.2 不同品種梨酒對(duì)DPPH·清除能力的比較

清除DPPH·是最為常見(jiàn)的體外檢測(cè)抗氧化劑清除自由基的方法[15]。不同品種梨釀制梨酒對(duì)DPPH·的清除能力不同(圖3)，按清除率大小依次是南果梨酒>新高梨酒>秋月梨酒>南水梨酒、雪青梨酒、晚秀梨酒、黃冠梨酒、雪梨梨酒>鴨梨梨酒、紅香酥梨酒、早酥紅梨酒。

酚類物質(zhì)是葡萄酒中的主要抗氧化成分[16]。為了研究酚類物質(zhì)和DPPH·清除率的關(guān)系，對(duì)不同品種梨酒中這11個(gè)變量進(jìn)行偏最小二乘回歸分析(PLS)，建立如下方程：

S=26.625 1+0.013 6×X1+0.042 8×X2+8.695 7×X3+0.506 0×X4，

(2)

式中：

S——梨酒對(duì)DPPH·清除率，%；

X1——熊果苷，μg/mL；

X2——綠原酸，μg/mL；

X3——咖啡酸，μg/mL；

X4——表兒茶素，μg/mL。

圖3 不同品種梨酒對(duì)DPPH·的清除能力比較

Figure 3 Comparison of scarving capacity of DPPH radicals of different pear wine

由方程可知，對(duì)清除DPPH·有貢獻(xiàn)的酚類物質(zhì)有熊果苷、綠原酸、咖啡酸和表兒茶素[VIP>0.8(VIP，variable importance for projection，變量對(duì)于結(jié)果的重要性)]。

酚酸具有良好的抗氧化活性，特別是具有鄰位羥基結(jié)構(gòu)的酚酸[17]如咖啡酸，在本研究中由于其在PLS方程中系數(shù)最大，因此認(rèn)為它對(duì)DPPH·清除率貢獻(xiàn)最大。

酚類物質(zhì)的抗氧化性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]。它特有的酚羥基結(jié)構(gòu)，具有供電子作用，通過(guò)提供活潑的氫捕捉機(jī)體內(nèi)活性氧等自由基，阻斷了自由基對(duì)機(jī)體的損傷。一般認(rèn)為具有如下結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)清除自由基能力強(qiáng)：① 不飽和C環(huán)上有3-羥基基團(tuán)；② C環(huán)有2,3-雙鍵、3-羥基基團(tuán)和4-酮基基團(tuán)；③ B環(huán)有鄰位羥基基團(tuán)，并且羥基沒(méi)有被糖化。表兒茶素滿足第一和第三個(gè)結(jié)構(gòu)條件，所以具有強(qiáng)抗氧化性，在方程中顯示出對(duì)清除DPPH·具有重要貢獻(xiàn)。綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸縮合而成的酯，屬于酚類化合物。 由于分子具有鄰二酚羥基，因此具有強(qiáng)還原性而易被自由基氧化[19]，從而表現(xiàn)出很好的自由基清除能力。

在蘋果的酚類物質(zhì)中，表兒茶素抗氧化能力最強(qiáng)[20]，盧娟芳等[21]報(bào)道在其研究的多個(gè)桃品種中，早露蟠桃含有的表兒茶素含量極高(238.79 μg/g·FW)，綠原酸含量一般(42.69 μg/g·FW)，但抗氧化能力最強(qiáng)，也說(shuō)明了表兒茶素的抗氧化能力高于綠原酸。在本研究的PLS方程中，表兒茶素的系數(shù)遠(yuǎn)大于綠原酸，印證了這一觀點(diǎn)。

除了羥基位置，羥基數(shù)目也影響抗氧化活性。羥基數(shù)目越多，可提供的氫原子越多，抗氧化活性越強(qiáng)[22]。熊果苷分子具有4個(gè)酚羥基基團(tuán)，在本試驗(yàn)中對(duì)DPPH·清除率具有一定貢獻(xiàn)。沒(méi)食子酸和原兒茶酸分別具有3個(gè)和2個(gè)酚羥基基團(tuán)，對(duì)DPPH·清除率的貢獻(xiàn)均小于熊果苷(VIP<0.8)，因此未能進(jìn)入方程。

3 結(jié)論

(1) 在11個(gè)品種梨釀制的梨酒中共分離鑒定出10種酚類物質(zhì)。熊果苷在11個(gè)品種梨酒中含量均最高，其次是兒茶素和3,4-二羥基苯丙氨酸。綠原酸、表兒茶素僅在南果梨酒中含量較高，在其他品種梨酒中含量均較低。沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁的含量在11個(gè)品種梨酒中均不足5 μg/mL，咖啡酸和槲皮素含量甚至不足2 μg/mL。南果梨酒酚類物質(zhì)總量最高，為316.35 μg/mL，鴨梨、南水和紅香酥梨酒最低，分別為44.37，40.91，37.70 μg/mL。

(2) 目前關(guān)于葡萄酒酚類物質(zhì)的報(bào)道[23-25]大多是紅葡萄酒，而對(duì)白葡萄酒的酚類物質(zhì)研究則少有文獻(xiàn)報(bào)道。研究者[18]在“西拉”“蛇龍珠”“赤霞珠” 所釀制的新鮮干紅葡萄酒中，分離檢測(cè)出了28種酚類物質(zhì)，其中含量較高的酚類物質(zhì)有龍膽酸、沒(méi)食子酸、p-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素，楊梅素、槲皮甙等。由于紅葡萄酒采用帶皮發(fā)酵工藝，葡萄皮中富含的酚類物質(zhì)，賦予了其豐富的多酚。而本研究所用梨酒為了保持梨酒的色澤和口感，參照了白葡萄酒去皮發(fā)酵的釀造工藝，因此梨酒的酚類物質(zhì)組成和含量與紅葡萄酒相差很多，期望后續(xù)有白葡萄酒的酚類物質(zhì)研究報(bào)道和梨酒做此方面的比較。

(3) 不同品種梨酒對(duì)DPPH·的清除能力不同，依次是南果梨酒>新高梨酒>秋月梨酒>南水梨酒、雪青梨酒、晚秀梨酒、黃冠梨酒、雪梨梨酒>鴨梨梨酒、紅香酥梨酒、早酥紅梨酒。通過(guò)PLS分析得知，對(duì)清除DPPH·有貢獻(xiàn)的酚類物質(zhì)有熊果苷、綠原酸、咖啡酸和表兒茶素。

本試驗(yàn)僅就梨酒對(duì)DPPH·清除能力進(jìn)行了測(cè)定，為了更好地評(píng)價(jià)梨酒的抗氧化能力還需要從清除羥自由基、超氧自由基等方面進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)本研究采用軟件分析得出了對(duì)清除DPPH·有貢獻(xiàn)的酚類物質(zhì)，未來(lái)隨著分離濃縮技術(shù)的進(jìn)步，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)低含量酚類物質(zhì)的提取分離，從而驗(yàn)證其對(duì)自由基的清除能力，為開(kāi)發(fā)保健品或藥品提供新的原材料。