李 南 ，牛鵬飛 ，閆 楓 ，田承華 ，李 珍 ，姜建芳 ，申曉慧 ，欒 鑫 ，田懷東 ，3

（1.山西大學生命科學學院，植物種質(zhì)與作物資源遺傳實驗室，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西景康農(nóng)業(yè)技術推廣有限公司，山西壽陽045400）

MNU（N-甲基-N-亞硝基脲）是一種水溶性的化學誘變劑，對鳥嘌呤具有烷化作用。SATOH等[1]使用MNU磷酸鹽緩沖液對水稻的穗部進行誘變，成功獲得了系列突變體。從水稻的誘變結果可以得知，MNU是一種高效的可以誘導農(nóng)作物發(fā)生基因突變的化學誘變劑。目前，MNU在哺乳動物的腫瘤誘發(fā)以及微生物誘變中運用較為廣泛，但在農(nóng)作物的應用中，除水稻外，其他作物生殖細胞的MNU誘變未見報道。近年來，山西大學生命科學學院植物種質(zhì)與作物資源遺傳實驗室對水稻、玉米及高粱的玉米花粉生殖細胞進行大規(guī)模MNU誘變[2-3]。其中，玉米優(yōu)異自交系A378是具有Lancaster與Reid血緣屬性互補的優(yōu)異玉米自交系，該自交系穗位低，果穗長，穗部性狀好，適合作母本。因此，選取該自交系作為MNU誘變處理的親本用于繁育后代群體。

玉米雄穗器官的形成是一個動態(tài)的發(fā)育過程。這個過程主要包括生長錐未伸長期與生長錐伸長期、小穗分化期、小花分化期、性器官分化形成期。玉米雄性生殖器官發(fā)育成熟后，開花散粉與雌穗完成授粉過程[4]。玉米雄穗著生于莖稈頂端，由主軸、分枝、小穗和小花組成。主軸上著生有4～11行成對小穗；分枝的數(shù)目不定，可能隨生理和環(huán)境條件的變化而改變，各分枝通常有2行成對小穗[5]。玉米雄穗研究過去主要聚焦于雄性生殖器官及相關組織的發(fā)育過程、組織構成、生理特性及其與栽培環(huán)境間的相關性[6-7]。近10多年來，國內(nèi)外開始深入關注玉米雄穗器官的發(fā)育、構成和性狀表達的遺傳機制研究。

玉米雄穗性狀突變體的開發(fā)和利用是開展玉米雄性生殖器官及相關組織遺傳學研究的有效途徑。截至目前，國內(nèi)外主要鑒定出12個玉米花粉不育突變基因（ms系列）[8-13]。這些花粉不育突變影響花粉壁的發(fā)育、小孢子壁的發(fā)育、小孢子的形成或影響花粉細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂，而關于玉米雄穗器官及相關組織的其他性狀突變體未見報道。全面闡明玉米雄穗發(fā)育和性狀表達的遺傳機制，有必要創(chuàng)制并解析更加多樣的雄穗突變材料。

本研究通過玉米成熟花粉生殖細胞MNU處理所得的后代群體雄穗性狀的篩查分析，創(chuàng)制出3種類型的玉米雄穗突變系，旨在為進一步在玉米雄性生殖器官突變體的初步鑒定與遺傳分析等方面提供理論依據(jù)，對闡明玉米雄性不育生殖器官的基因鑒定及其功能解析具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

將山西大學生命科學學院植物種質(zhì)與作物資源遺傳實驗室前期研究中MNU處理優(yōu)異玉米自交系（A378）成熟花粉生殖細胞所得的543粒M1種子種植于山西大學特色生物資源研究基地，進行M1～M2后代群體的繁育（圖1）。

1.2 試驗方法

2016年種植M1種子群體、培育M1成株群體，通過M1成株群體的自交獲得M2籽粒群體，按每份播種30粒的標準于2017年種植M2籽粒群體，進一步獲得M2成株群體（圖1）。在M1～M2籽粒與植株群體的繁育過程中，籽粒群體中發(fā)生的無胚、畸形胚以及幼苗群體中發(fā)生的白化苗、黃化苗、畸形苗與弱化苗等現(xiàn)象，導致群體數(shù)目的逐代衰減。通過543粒M1種子群體的繁育，分別得到358株M1成株與341個M2成株群體。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 M1與M2雄穗性狀的篩查 通過與野生型自交系（A378）雄穗性狀相比，主要調(diào)查了所得成株群體植株雄穗主軸與分枝的形態(tài)、分枝數(shù)目、小穗與小花形態(tài)以及花粉成熟期散粉狀態(tài)等雄穗的外觀性狀特征。將顯著變化的雄穗外觀性狀在M1與M2成株群體中的可遺傳性以及在M2成株群體中的表型分離，作為突變性狀的判斷依據(jù)。

1.3.2 玉米花粉活力染色及顯微觀察 參考崔桂梅等[14]的方法，使用含0.1 mol/L磷酸鹽、0.5%TTC的染色液（pH值7.2），對形態(tài)特征發(fā)生顯著變化的M1成株與M2成株的離體花粉進行染色。使用CH20BIMF200顯微鏡對染色后的花粉進行觀察，并分析其活力和育性。

2 結果與分析

2.1 玉米雄穗外觀性狀突變系的獲得

在358株M1成株群體中，僅僅出現(xiàn)3株雌穗頂生的候補突變系，其他類型的雄穗性狀變化并未表現(xiàn)。由于M1雌穗頂生候補突變系無散粉能力，所以，將野生型自交系的花粉授于該候補突變系的正常雌穗，獲得雜交的M2種子；將其余M1成株自交，獲得M2種子。在341份M2成株群體中，觀察到1份雄穗雌化候補突變體性狀的再現(xiàn)，并篩查到6份雄性不育的候補突變系和2份雄穗分枝畸形的候補突變系（表1）。在雄穗外觀上，M2雄性不育候補突變系表現(xiàn)出雄穗主軸發(fā)育不良、無分枝、無花粉的特征，M2雄穗雌化候補突變系呈現(xiàn)雄穗主軸退化、雌穗頂生、分枝上部分小穗呈子房狀雌化的特征，M2雄穗分枝畸形候補突變系具有正常發(fā)育的主軸，顯示分枝短小、簇生的特征（圖2）。

表1 M2群體中篩查到的雄穗突變系的外觀特征

2.2 玉米雄穗候補突變系花粉的活力分析與顯微觀察

進一步對M2候補突變系的離體花粉進行TTC活力染色分析與顯微觀察，證實了所創(chuàng)制的雄性不育候補突變系喪失形成花粉的能力（圖3）。雄穗雌化候補突變系的分枝小穗雖然包含少量的弱化花粉顆粒，但無散粉與受精能力；雄穗分枝畸形候補突變系的花粉量明顯減少，有一定的授粉與受精能力。

2.3 玉米雄穗突變性狀的遺傳樣式解析

對M2成株群體中各雄穗突變性狀的表型分離進行了分析。再現(xiàn)的雄穗雌化突變體性狀在其與野生型自交系雜交的M2群體中表現(xiàn)出顯性遺傳的表型分離規(guī)律，所有6份雄性不育突變體的性狀在其自交的M2群體中均表現(xiàn)出隱性遺傳的表型分離規(guī)律，2份雄穗分枝畸形突變體的性狀在其自交的M2群體中也表現(xiàn)出隱性遺傳的表型分離規(guī)律（表2）。

表2 M2群體中雄穗突變系的表型分離

3 結論與討論

國內(nèi)外已報道40多個玉米隱性核不育基因突變、部分雄性不育突變的初步定位與功能解析及12個雄性不育突變基因（ms系列）的克隆進展[8-13]。其中，ms1，ms2，ms7突變導致花粉壁發(fā)育異常，ms10和ms13突變引起小孢子壁的加厚與降解，ms6，ms8，ms22和 ms23突變影響小孢子的正常形成，ms5突變導致有絲分裂期的花粉細胞中單核或雙核的缺失，ms14突變抑制了花粉細胞的減數(shù)分裂，ms17突變引起紡錘體形成的異常[15-21]。本研究所創(chuàng)制的6份雄性不育突變系具有的主軸發(fā)育不良、無分枝、無花粉性狀變化起因于隱性突變，可能與花粉的形成與發(fā)育過程有關。期待這些突變體的利用可進一步促進關于花粉形成的發(fā)育生物學與遺傳性研究。

關于其他類型的雄穗性狀突變體，PHILLIPS等[22]與丁帥濤等[23]分別報道了小穗退化玉米突變體與光溫敏無雄穗系玉米突變體，但關于其他類型雄穗性狀的突變基因未見報道。本研究創(chuàng)制出的雄穗雌化突變系具有主軸退化、雌穗頂生、部分分枝小穗雌化的性狀特征，而雄穗分枝畸形突變系具有分枝短小、簇生的性狀特征。這些突變系的雄穗性狀變化可能起因于和小穗、小花、性器官組織細胞分化有關的基因突變。這些突變體有望用于關于雄穗組織分化與形態(tài)構建的遺傳學研究。

玉米雄穗器官組織的形成和發(fā)育與玉米產(chǎn)量有著密切的關系。本研究所創(chuàng)制的系列雄穗突變體除了可用于雄穗生殖器官與組織的發(fā)育生物學與遺傳性研究之外，還有望適用于關于玉米產(chǎn)量的遺傳育種學研究。