馮國飛，尤慧華，張志鋒

（金華市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 金華 321000）

喉癌治療方法主要為手術和放化療為主的綜合性治療，而對于轉(zhuǎn)移和復發(fā)的喉癌患者5年生存率和生活質(zhì)量較差。因此，探索治療喉癌的新方法具有重要意義[1]。MicroRNA（miRNA）在惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因和抑制基因的作用，研究miRNA在惡性腫瘤中的表達可為惡性腫瘤的靶基因治療提供依據(jù)[2-3]。miR-196a在多種惡性腫瘤中表達異常[4-5]，可影響惡性腫瘤的侵襲和遷移，但miR-196a對喉癌細胞侵襲和遷移的影響尚不清楚。本文探討miR-196a對喉癌細胞侵襲和遷移的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集選取2015年1月—2017年12月金華市中心醫(yī)院70例喉癌患者的手術切除標本，術中采集每例患者喉癌組織和癌旁組織（距離癌組織邊緣≥0.5 cm）于液氮中保存?zhèn)溆??；颊呔?jīng)病理證實，術前未接受放化療等其他抗腫瘤治療，簽署知情同 意書。

1.1.2 細胞株人喉癌Hep-2細胞株（美國菌種保藏中心）。

1.1.3 主 要 試 劑Tanswell小 室、Matrigel膠、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶及BCA蛋白濃度測定試劑盒等購自美國Sigma公司，兔抗人磷脂酰肌 醇-3-激 酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）多克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體及辣根過氧化酶標記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）抗體購自美國Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000及Trizol試劑盒購自美國Santa Cruze公司，miR-196a引物和內(nèi)參由上海天根生化科技有限公司設計并合成，pcDNA/miR-196a和pcDNA/miR-NC重組質(zhì)粒購自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理將人喉癌Hep-2細胞株接種到6孔板中，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞融合≥ 80%時將其分為空白對照組、陰性對照組及siRNA組，每組設7個復孔。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，siRNA組細胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-196a，陰性對照組細胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-NC，空白對照組不做處理。轉(zhuǎn)染后再恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞備用。

1.2.2 組織和細胞中miR-196a水平測定從液氮中取出喉癌組織和癌旁組織標本各50 mg，充分研磨后加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取喉癌組織和癌旁組織總RNA。取各組生長良好的喉癌細胞加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取喉癌細胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA純度，取組織和細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用RT-PCR測定組織和細胞中miR-196a水平，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火40 s，72℃延伸5 min，共35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算組織和細胞中miR-196a水平。

1.2.3 喉癌細胞侵襲能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細胞置于EP管中（每組取1×105個細胞），加入培養(yǎng)基重懸。Transwell小室鋪Matrigel膠，重懸后的細胞置于Transwell小室中，在小室下層加入含胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設7個復孔。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，擦除小室內(nèi)細胞，染色固定，在顯微鏡下觀察細胞侵襲情況。

1.2.4 喉癌細胞遷移能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細胞加入到24孔Transwell小室的上室（每組取1×105個細胞）。將含血清培養(yǎng)基加入到小室的下室，每組設7個復孔，培養(yǎng)48 h后取出小室，進行固定和染色，去除小室上層側(cè)位細胞，顯微鏡下觀察喉癌細胞遷移情況。

1.2.5 喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細胞，棄去培養(yǎng)液，介入離心管中，加入RIPA裂解液冰浴裂解30 min，提取喉癌細胞總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白純度。采用Western blotting檢測喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平。將蛋白提取液電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗（一抗為兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人p-PKB多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體及GAPDH抗體）孵育24 h；加入二抗（辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG）孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參，用ECL化學發(fā)光顯影試劑盒進行顯影。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶吸光度，目標蛋白的相對表達量=目標蛋白的吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.2.6 喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細胞，加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min，提取各組喉癌細胞總RNA。采用RT-PCR測定喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及 Bcl-2 mRNA水平，方法同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較

喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平分為別（1.87±0.13）、（1.00±0.02），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=55.341，P=0.000）；喉癌組織中miR-196a水平高于癌旁組織。見圖1。

2.2 3組喉癌Hep-2細胞株中miR-196a水平 比較

圖1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較（n=70）

空白對照組、陰性對照組及siRNA組喉癌Hep-2細胞株中miR-196a水平分別為（1.00±0.01）、（0.97±0.03）及（0.42±0.05）。3組喉癌Hep-2細胞株中miR-196a水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=639.800，P=0.000）；siRNA組喉癌Hep-2細胞株中miR-196a水平低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細胞株中miR-196a水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 3組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移能力比較

3組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移能力比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；siRNA組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移細胞數(shù)低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1和圖2、3。

表1 3組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移細胞數(shù)比較（個，±s）

表1 3組喉癌Hep-2細胞株侵襲和遷移細胞數(shù)比較（個，±s）

組別 侵襲細胞數(shù) 遷移細胞數(shù)空白對照組 185.26±21.35 213.24±24.35陰性對照組 182.37±22.56 211.17±23.54 siRNA組 98.19±11.47 107.46±12.07 F值 46.852 59.427 P值 0.000 0.000

2.4 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較

3組 喉 癌 細 胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；siRNA組喉癌細胞PI3K、p-PKB及Bcl-2蛋白水平低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），而Bax水平高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）?？瞻讓φ战M與陰性對照組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和圖4。

圖2 3組喉癌Hep-2細胞株侵襲能力（×200）

圖3 3組喉癌Hep-2細胞株遷移能力（×200）

表2 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

表2 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

組別 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白空白對照組 0.53±0.09 0.62±0.11 0.37±0.06 0.45±0.06陰性對照組 0.51±0.07 0.61±0.12 0.38±0.05 0.44±0.07 siRNA組 0.23±0.04 0.32±0.07 0.59±0.10 0.19±0.04 F值 40.466 19.417 20.130 45.119 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 3組喉癌細胞中PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白的表達

2.5 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較

空白對照組、陰性對照組、siRNA組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相 對 表 達 量 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，siRNA組喉癌細胞PI3K、p-PKB及Bcl-2 mRNA水平低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），Bax mRNA水平高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達量比較（±s）

表3 3組喉癌細胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達量比較（±s）

組別 PI3K mRNA p-PKB mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA空白對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.01 1.00±0.02陰性對照組 1.01±0.02 1.00±0.01 1.03±0.02 0.98±0.01 siRNA組 0.48±0.07 0.54±0.08 1.76±0.14 0.42±0.05 F值 311.274 214.667 193.527 758.800 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

miRNAs在人類和真核生物中廣泛存在，其為內(nèi)源性小分子非編碼RNA。在惡性腫瘤方面，miRNAs可作為癌基因或者抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。miR-196a為miRNA家族成員之一，近年來在惡性腫瘤中的作用備受關注，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因的作用[8]，在胃癌、頭頸癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織和細胞中呈高表達，可促進惡性腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，抑制惡性腫瘤細胞的凋亡[9-10]。國外JIN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a在喉癌中表達上調(diào)，并通過下調(diào)喉癌中的p27kip1促進喉癌細胞增殖。SAITO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a在喉癌組織中表達上調(diào)，有望成為喉癌的診斷生物標志物和治療靶點。國內(nèi)關于miR-196a在喉癌組織中表達的研究較少，本文對金華市中心醫(yī)院喉癌患者進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a在喉癌組織中升高，與國外研究結(jié)果一致[11-12]。

喉癌是頭頸部惡性程度比較高的惡性腫瘤之一，喉癌的復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是影響喉癌治療和預后的主要因素。在喉癌的早期治療中，如能在消滅喉癌細胞的同時抑制喉癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移，則對改善喉癌的預后具有重要意義。miR-196a與惡性腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關。吳曉鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a可通過抑制ANXA1等基因的表達參與食管癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。張健等[14]研究發(fā)現(xiàn)，沉默miRNA-196a可抑制結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外關于miR-196a對喉癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移影響的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-196a可抑制喉癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，表明miR-196a參與喉癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程，下調(diào)miR-196a有望成為防止喉癌轉(zhuǎn)移的靶點。

喉癌的發(fā)生、發(fā)展受多種信號通路調(diào)控，PI3K/PKB信號通路在喉癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15]。YANG等[16]發(fā)現(xiàn)，PI3K/PKB/mTOR通路參與喉癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。miR-196a可通過PI3K/PKB信號通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。GUERRIERO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a為肺癌細胞中異常PI3K/PKB信號傳導的關鍵介質(zhì)。SHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a過表達通過PTEN/PKB/FOXO1途徑促進細胞增殖，并抑制細胞凋亡。miR-196a是否通過PI3K/PKB信號通路參與喉癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移？本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默miR-196a可降低PI3K、p-PKB及Bcl-2水平，Bax水平升高。PI3K被激活后可催化產(chǎn)生PIP3，促使PKB被激活，激活的PKB激活其下游的靶基因，從而參與對細胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用[19]。Bcl-2和Bax為PI3K/PKB信號通路的下游基因，Bcl-2為抑制細胞凋亡基因，Bax為促凋亡基因[20-21]。沉默miR-196a可降低喉癌細胞PI3K、p-PKB及Bcl-2水平，升高Bax水平，表明下調(diào)miR-196a水平可能通過PI3K/PKB信號通路及其下游的Bcl-2和Bax基因參與喉癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，喉癌組織中miR-196a水平升高，下調(diào)miR-196a水平可抑制喉癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，其機制可能為miR-196a通過PI3K/PKB信號通路及其下游靶基因抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。