錢 哲，繆文興*，李林東，謝澄鋮，黃桂成，馬 勇，王建偉

（1.江陰市中醫(yī)骨傷醫(yī)院，江蘇 無錫 214422；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇 南京 210023）

1 前 言

半月板損傷是由于外傷導(dǎo)致的不穩(wěn)定和關(guān)節(jié)活動(dòng)喪失引起的，它可導(dǎo)致疼痛或殘疾、關(guān)節(jié)退化和骨關(guān)節(jié)炎癥狀[1-2]。膝關(guān)節(jié)半月板沒有完全血管化，血液僅供給其結(jié)構(gòu)的外三分之一，其自發(fā)修復(fù)的可能性有限[3]。大量研究表明半月板損傷與炎癥途徑密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平的變化的變化，主要包括白細(xì)胞介素-1(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α (TNF子-α)，影響的途徑主要有NLPR3和NF-κB[4-5]。炎癥小體是一種大的多蛋白復(fù)合物，可作為白介素-1β和白介素-18的成熟胱天蛋白酶-1激活促發(fā)因子。它們根據(jù)其整體PRR家族成員的組成進(jìn)行分類，這些成員作為支架蛋白促進(jìn)胱天蛋白酶-1的募集、聚集和自動(dòng)激活，最典型的炎癥體是NLRP3炎癥體。NLRP3既是支架蛋白，也是一種凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白，含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(ASC)銜接子和半胱天冬酶-1。各種刺激通過硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）會(huì)引起NLRP3炎性通路的活化，誘導(dǎo)IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的釋放[6-7]。NF-κB是一種典型的促炎轉(zhuǎn)錄因子，含有p50/p65和IκBα。同時(shí)，研究表明NF-κB可以觸發(fā)和調(diào)節(jié)下游促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8]。芍藥苷作為芍藥的有效成分具有多種藥理活性，包括抗癌、抗炎、抗肺纖維化抗痙攣?zhàn)饔肹9]。然而芍藥苷對(duì)半月板損傷修復(fù)作用的潛在機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在進(jìn)一步探討其在半月板損傷中的潛在機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 試劑

芍藥苷購(gòu)自購(gòu)自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司(中國(guó)，天津)。白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自于南京科創(chuàng)生物技術(shù)公司 (中國(guó)，南京)。所有抗體均購(gòu)自于Cell Signaling Technology (Danvers, USA)公司。

2.2 動(dòng)物

動(dòng)物60只成年新西蘭雄性白兔購(gòu)自北京維塔爾有限公司，并根據(jù)動(dòng)物倫理委員會(huì)機(jī)構(gòu)指南在GLP實(shí)驗(yàn)室的特定無病原體條件下飼養(yǎng)。動(dòng)物被保存在常規(guī)的動(dòng)物設(shè)施中，在22～24℃的恒定溫度下，在12小時(shí)的光照/12小時(shí)的黑暗循環(huán)環(huán)境中。將家兔隨機(jī)分為4組(每組15只)：正常組、半月板損傷（模型組）、模型組+芍藥苷(20，40 mg/kg)組。除正常組和模型組外，芍藥苷(20，40 mg/kg)組連續(xù)給藥7天。除正常組外，其余三組均進(jìn)行手術(shù)。所有的手術(shù)都是在同一個(gè)手術(shù)室進(jìn)行的，使用的是標(biāo)準(zhǔn)操作程序。動(dòng)物外科中心由兩名資深外科醫(yī)生組成。外科手術(shù)肌肉注射50 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg塞來昔布麻醉。刮除每只動(dòng)物的雙側(cè)膝蓋后，手術(shù)區(qū)域用碘/酒精消毒。在無菌條件下，前角和內(nèi)側(cè)半月板體。后腿的左膝通過一個(gè)完整的關(guān)節(jié)切口暴露出來。髕骨外翻允許關(guān)節(jié)最大程度彎曲。在半月板前部做了一個(gè)2.0毫米的斜切口。全楔形缺損。半月板組織的一小部分被切除，留下一個(gè)有缺陷的區(qū)域。

2.3 滑膜中細(xì)胞因子測(cè)定

按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組別家兔滑膜中IL-1β、IL-6,TNF-α的含量。

2.4 半月板組織病理學(xué)

半月板組織固定在4%中性福爾馬林溶液中。然后將組織包埋在石蠟中，切成4毫米厚的切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡（200倍）下觀察觀察組織病理學(xué)變化。

2.5 蛋白質(zhì)印跡

將組織置于含0.1%苯甲磺酰氟的冰冷RIPA緩沖液中溶解。總蛋白含量用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量。等量的蛋白用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳加載。室溫下，將從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移的聚偏氟乙烯膜在脫脂乳中封閉2小時(shí)以上。然后將聚偏氟乙烯膜與適當(dāng)濃度的特異性抗體在4℃孵育過夜。第二天，在用TBST洗滌三次后，將聚偏氟乙烯膜與第二抗體在室溫孵育1小時(shí)。免疫反應(yīng)帶與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒相互作用，并在凝膠成像系統(tǒng)上可視化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 芍藥苷對(duì)半月板損傷兔滑膜炎癥細(xì)胞因子的影響

檢測(cè)滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。結(jié)果如表1所示，半月板兔滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯高于正常組（P＜0.01）。芍藥苷(20，40 mg/kg)能顯著降低滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平（P＜0.01）。

表1 芍藥苷對(duì)半月板損傷兔滑膜炎癥細(xì)胞因子的影響(n=15)

3.2 芍藥苷對(duì)半月板病理變化的影響

正常組兔半月板組織學(xué)分析觀察正常組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。半月板損傷模型組表現(xiàn)為滑膜水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮變性。芍藥苷(20，40 mg/kg)顯著改善上述病理變化(圖1)。

圖1 芍藥苷對(duì)半月板病理變化的影響(×200倍)

3.3 芍藥苷對(duì)半月板Txnip/NLRP3/NF-κB通路的影響

與對(duì)照組相比，模型組 Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平升高（P＜0.01），Trx水平較低（P＜0.01）。與模型組相比，芍藥苷(20，40 mg/kg)能夠顯著降低Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平（P＜0.01），升高Trx水平（P＜0.01）（圖2）。

4 討 論

半月板損傷會(huì)影響膝關(guān)節(jié)功能障礙。然而目前尚缺乏促進(jìn)半月板愈合的有效治療方法。雖然，關(guān)節(jié)鏡下切除半月板撕裂仍然是最常見的治療方法，但手術(shù)會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)表面暴露壓力增加，影響骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[10]。芍藥苷作為芍藥的有效成分，具有多種藥理活性[9]。然而芍藥苷對(duì)半月板損傷修復(fù)作用的潛在機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在進(jìn)一步探討其在半月板損傷中的潛在機(jī)制。

圖2 芍藥苷對(duì)半月板Txnip/NLRP3/NF-κB通路的影響

TNF-α由單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)作用。IL-1β是一種與組織破壞或水腫有關(guān)的促炎細(xì)胞因子。IL-6具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[11]。研究證實(shí)半月板損傷的病理過程中始終伴隨著炎癥[12]，而患有炎癥時(shí)循環(huán)的促炎細(xì)胞因子可以引起膝關(guān)節(jié)滑膜的廣泛變化，例如IL-6、IL-1β及TNF-α。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)半月板損傷兔滑膜中炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α顯著升高，芍藥苷(20，40 mg/kg)顯著降低滑膜炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α。

NF-κB是一種經(jīng)典的促炎轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)生成的最重要因子之一[13]。此外Txnip/NLRP3也是調(diào)節(jié)炎癥的重要信號(hào)。本研究證實(shí)半月板損傷兔滑膜Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平升高，Trx蛋白表達(dá)水平降低。芍藥苷(20，40 mg/kg)能夠使Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平降低，Trx蛋白表達(dá)水平升高。綜上所述，芍藥苷對(duì)兔半月板損傷有抑制抑制炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制主要與調(diào)控Txnip/NLRP3/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。