劉磊，郝亞亞，鄧素輝，王坤，李江，王麗華，樊春海，李嘉雋,＊，柳華杰,＊中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 20800

2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

隨著納米材料的蓬勃發(fā)展和在生物、環(huán)境、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其帶來(lái)的生物安全性以及生物效應(yīng)等問(wèn)題引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。例如，納米金、銀等貴金屬納米顆粒在臨床醫(yī)學(xué)診斷和抗菌等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用1,2。目前科學(xué)家已經(jīng)從多個(gè)層次開(kāi)展相關(guān)研究，例如在分子層面研究了納米材料與聚合物高分子、小分子、生物大分子的相互作用3,4，在細(xì)胞層面研究了納米材料與細(xì)胞及其微環(huán)境的相互作用5,6，在活體層面研究了納米材料進(jìn)入活體的過(guò)程和生物效應(yīng)等等7,8。細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單元，研究其與納米材料的相互作用機(jī)制對(duì)于我們理解納米材料產(chǎn)生的效應(yīng)具有重要意義。

顯微鏡成像技術(shù)在研究貴金屬納米材料與細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著重要作用9。例如電子顯微鏡、原子力顯微鏡、近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡、暗場(chǎng)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等，利用顯微鏡可以觀察貴金屬納米材料在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位等信息。然而由于成像方法本身的特點(diǎn)以及所用探針性質(zhì)的限制，目前對(duì)于實(shí)時(shí)觀察貴金屬納米顆粒與細(xì)胞的相互作用還存在著巨大挑戰(zhàn)。例如電子顯微鏡不能對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像，原子力顯微鏡和近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡的掃描速率很慢等，這些都限制了其在細(xì)胞與納米材料相互作用實(shí)時(shí)研究中的應(yīng)用。單分子、單顆粒水平的熒光成像技術(shù)提供了揭示細(xì)胞內(nèi)單分子水平生化反應(yīng)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有效手段，使實(shí)時(shí)追蹤納米顆粒的運(yùn)動(dòng)和定位信息成為可能10-12。然而，現(xiàn)有的基于熒光探針的單顆粒成像方法通常存在一對(duì)無(wú)法克服的矛盾：一方面，為了實(shí)現(xiàn)較高的時(shí)空分辨率，我們需要借助大功率光源激發(fā)單顆粒上標(biāo)記的熒光探針，以便在較短時(shí)間內(nèi)搜集足夠的熒光信號(hào)；而另一方面，強(qiáng)光源帶來(lái)的熒光漂白作用又限制了長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)成像的能力。

貴金屬納米顆粒具有獨(dú)特的局域表面等離子體共振(LSPR)特性，其發(fā)出的散射光可以被暗場(chǎng)顯微鏡(Dark Field Microscope，DFM)探測(cè)到。近年來(lái)的研究表明，基于納米金等顆粒自身的LSPR性質(zhì)，進(jìn)行單顆粒暗場(chǎng)成像，避免了熒光成像方法的光漂白問(wèn)題，因此成為了研究貴金屬納米顆粒與細(xì)胞相互作用的有效手段13-16。利用暗場(chǎng)顯微鏡，在單分子水平上對(duì)金屬納米顆粒的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行分析，對(duì)研究活細(xì)胞和組織的生物學(xué)行為、制備納米功能材料、開(kāi)發(fā)新的傳感器具有重要意義17-19。例如，通過(guò)檢測(cè)金屬納米顆粒的散射信號(hào)，可以分析其與細(xì)胞、生物分子的相互作用，揭示其聚集狀態(tài)與胞內(nèi)運(yùn)輸情況20-22。Xu小組通過(guò)單納米顆粒追蹤技術(shù)，成功觀察到其進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過(guò)程23-25，以及細(xì)胞膜和細(xì)胞壁對(duì)攝入金屬納米顆粒的選擇性26。Raschke、Nusz等多個(gè)小組研究了單個(gè)納米金顆粒與生物大分子的結(jié)合，并發(fā)展了相關(guān)的納米傳感器27-29。何彥課題組30基于納米顆粒間距離變化導(dǎo)致的 LSPR光譜變化，發(fā)展了研究細(xì)胞膜表面力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的新技術(shù)。

上述對(duì)單個(gè)金屬納米顆粒的LSPR光譜研究，采用的都是暗場(chǎng)顯微鏡-光譜儀聯(lián)用裝置。但是，現(xiàn)有的商業(yè)化暗場(chǎng)顯微鏡由于自帶光源一般使用鹵素?zé)簦鈴?qiáng)度弱、光譜范圍窄，造成在進(jìn)行單顆粒成像研究時(shí)，對(duì)散射信號(hào)較弱的樣品需要的光譜采集時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)更弱的樣品甚至完全無(wú)法實(shí)現(xiàn)信號(hào)的采集。例如，對(duì)于粒徑在30 nm以下的小顆粒納米金，現(xiàn)有的商業(yè)化儀器無(wú)法在單顆粒尺度對(duì)其進(jìn)行成像研究。另一方面，由于現(xiàn)有商業(yè)化儀器的封裝限制，只能進(jìn)行細(xì)胞輪廓的結(jié)構(gòu)成像，無(wú)法進(jìn)行功能成像，限制了對(duì)貴金屬納米顆粒與細(xì)胞相互作用研究的深入。例如現(xiàn)有暗場(chǎng)顯微鏡只能觀察到納米金進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程和狀態(tài)，無(wú)法同時(shí)觀察其與特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)共定位，獲得納米金與細(xì)胞內(nèi)部相互作用的細(xì)節(jié)信息。

針對(duì)以上關(guān)鍵問(wèn)題，本文首先通過(guò)設(shè)計(jì)重構(gòu)暗場(chǎng)顯微鏡的照明模式，實(shí)現(xiàn)了在單顆粒水平上，對(duì)散射信號(hào)較弱樣品的成功表征。我們利用超連續(xù)激光器作為外接光源，代替鹵素?zé)艄庠?，在?jīng)過(guò)光路耦合導(dǎo)入顯微鏡后，使對(duì)單個(gè)30 nm粒徑納米金的光譜采集時(shí)間可以縮短至1 ms。同時(shí)，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)功能成像的需求，我們通過(guò)加裝光片成像系統(tǒng)，集成了熒光成像功能，可實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行性質(zhì)和功能上的分析。這一整合系統(tǒng)在商業(yè)化暗場(chǎng)下加裝了一條斜照明光路，通過(guò)精確調(diào)整斜入射照明光的高度，實(shí)現(xiàn)光片成像，并可以通過(guò)對(duì)濾塊的調(diào)整分別收集熒光信號(hào)和散射信號(hào)，實(shí)現(xiàn)多模式成像共定位。整套系統(tǒng)可以提供全光譜、高照明強(qiáng)度的暗場(chǎng)寬場(chǎng)照明模式以及暗場(chǎng)聚焦照明模式。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

Hela細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院。3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、溶酶體染色劑(lysotracker)、CY3、胎牛血清(FBS)、雙抗青鏈霉素、胰酶(trypsin)均購(gòu)買(mǎi)于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，所有試劑未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。甲醇、乙醇購(gòu)買(mǎi)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，可直接使用。納米金和納米銀購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，超純水稀釋之后直接使用。35 mm玻璃底培養(yǎng)板購(gòu)于生友生物科技公司；蓋玻片、載玻片、細(xì)胞培養(yǎng)板和多孔板購(gòu)于康寧公司。所有溶液采用Millipore系統(tǒng)的milli-Q超純水(18 M?·cm電阻)制備。所有光學(xué)透鏡和鏡架購(gòu)于索雷博光電科技(上海)有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.2.1 納米金成像樣品的制備

首先將納米金顆粒吸附在玻璃表面，玻璃表面根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行清潔和硅烷化處理31。具體地，將洗凈后的蓋玻片浸泡在摩爾濃度1% APTES的甲醇溶液中放置 12 h，然后依次用甲醇和超純水沖洗玻璃片以去除多余的APTES和甲醇，之后放在120 °C的烘箱中3 h進(jìn)行老化。將20 μL濃度為 10-30 pmol·L-1的納米金溶液滴加在上述玻璃片上，5 min后用超純水沖洗玻璃片以除去沒(méi)有結(jié)合在玻璃片上的納米金，氮?dú)獯蹈珊髮⒉Ａ旁诎祱?chǎng)顯微鏡的載物臺(tái)上進(jìn)行觀察。

2.2.2 多模式全光譜暗場(chǎng)顯微鏡光路構(gòu)建

我們通過(guò)使用超連續(xù)激光器(NKT SuperK EXTREME EXW-12)作為照明光源，替代傳統(tǒng)的鹵素?zé)?，并改變其照明方式。在保留暗?chǎng)顯微鏡原有功能的情況下，完成了寬光譜采集、高采集速度的多模式成像暗場(chǎng)顯微鏡改造。如圖1光路圖所示，超連續(xù)激光器所產(chǎn)生的400-1200 nm波長(zhǎng)的連續(xù)譜激光首先穿過(guò)由兩塊透鏡與一個(gè)針孔組成的空間濾波系統(tǒng)進(jìn)行濾波與擴(kuò)束。擴(kuò)束后的激光由一塊中間帶有圓孔的反射鏡(ID1)反射，圓孔為橢圓形，長(zhǎng)軸7 mm，短軸5 mm，長(zhǎng)軸水平放置。此時(shí)，激光的外圍部分由反射鏡反射形成了環(huán)形光，中間部分則穿過(guò)了反射鏡的圓孔形成了光片照明模式的光源，直徑約5 mm。環(huán)形光被一組透鏡組(L3、L4)共軛至物鏡(OLYMPUS UPlanFLN)的后孔徑，并由后孔徑的邊緣被物鏡聚焦至一個(gè)尺度接近光學(xué)衍射極限的光斑。在原有濾片盒中二相色鏡的位置處安置一個(gè)尺寸與 ID1相同大小的圓孔反射鏡(ID2)。由樣品散射的光被同一個(gè)物鏡所收集，其中散射信號(hào)透過(guò) ID2的中孔，由光分路器(FC)實(shí)現(xiàn)分光，并被 CCD(OLYMPUS DP70)或者光譜儀(PRINSTON SP2300i)所接收。

圖1 多模式全光譜暗場(chǎng)顯微鏡照明成像原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the multi-mode DFM.

該系統(tǒng)還整合了一套光片照明模式，從反射鏡(ID1)圓孔中透過(guò)的激光經(jīng)由反射鏡反射至樣品的斜上方，并由一塊400 mm焦距的柱狀凹面反射鏡(THORLABS CCM254-100-P01)聚焦，從側(cè)方形成100 μm厚度的光片，進(jìn)行寬場(chǎng)照明。凹面反射鏡的高度調(diào)節(jié)可由手動(dòng)升降臺(tái)提供。

2.2.3 納米金暗場(chǎng)光譜采集與成像

將涂有納米金的載玻片放在暗場(chǎng)顯微鏡的載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)聚光鏡和物鏡的位置并移動(dòng)載物臺(tái)，在視野里找到納米金并進(jìn)行聚焦。切換使用60/0.5-0.9 NA的干物鏡，通過(guò)微調(diào)聚光鏡的位置來(lái)獲得最暗背景，微調(diào)Z軸和物鏡的數(shù)值孔徑(NA)來(lái)獲得最佳信噪比。調(diào)節(jié)CCD相機(jī)的曝光時(shí)間為100 ms，ISO靈敏度為400，獲取納米金的暗場(chǎng)照片。切換光路至光譜方向，利用配置了譜線600光柵的光譜儀，調(diào)整狹縫寬度來(lái)獲得單個(gè)納米金顆粒的光譜。

2.2.4 細(xì)胞內(nèi)納米金暗場(chǎng)成像

將HeLa細(xì)胞鋪在單孔玻璃底培養(yǎng)皿上，用1 ×PBS (磷酸緩沖液)將細(xì)胞洗滌2-3次，再加入0.2 mL含有 0.1 nmol·L-1納米金的培養(yǎng)基(gibco MEM)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。觀察之前用1 × PBS洗滌 3-4次，并更換為不含酚紅的培養(yǎng)基后，放在載物臺(tái)上進(jìn)行成像分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 多模式全光譜暗場(chǎng)成像原理

暗場(chǎng)顯微鏡又稱(chēng)作暗視野顯微鏡，成像原理在于使用暗場(chǎng)聚光鏡將光源中間部分光線屏蔽并聚焦，使其避開(kāi)物鏡的接收范圍，從而使檢測(cè)器只能接收到由樣品產(chǎn)生的散射光(見(jiàn)圖S1，Supporting Information)。在暗場(chǎng)模式下顯微鏡能極大的降低成像背景的亮度并提高成像信噪比，從而達(dá)到觀察弱散射信號(hào)樣品的目的。

傳統(tǒng)的暗場(chǎng)顯微鏡使用鹵素?zé)糇鳛楣庠?，其?qiáng)度以及光譜范圍不足以對(duì)單顆粒金屬納米顆粒進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。針對(duì)此，我們使用超連續(xù)激光器作為照明光源，并對(duì)光路進(jìn)行重構(gòu)。我們采用一塊中間帶有圓孔的反射鏡將超連續(xù)激光器所產(chǎn)生的全光譜激光分為兩路。其中激光的外圍部分由反射鏡反射形成了環(huán)形光，這束高強(qiáng)度激光進(jìn)而被物鏡聚焦在樣品上，產(chǎn)生較強(qiáng)的散射信號(hào)，極大地縮短了對(duì)單分子金屬顆粒采集光譜的時(shí)間。另一方面，激光的中間部分則穿過(guò)了反射鏡的圓孔形成了光片照明模式的光源，通過(guò)精確調(diào)整這束斜入射照明光的高度，我們可以提供寬光譜、高照明強(qiáng)度的暗場(chǎng)光片照明模式。通過(guò)在光路中加裝帶通濾片與選擇顯微鏡中與之對(duì)應(yīng)的濾片盒，該系統(tǒng)還能提供與暗場(chǎng)成像共定位的熒光成像功能。樣品所產(chǎn)生的散射光及熒光被同一個(gè)物鏡所收集，并進(jìn)而被聚焦至CCD相機(jī)或光譜儀，可以分別實(shí)現(xiàn)暗場(chǎng)成像、熒光成像與光譜分析等功能。

通過(guò)以上改造，該儀器在基本暗場(chǎng)采集成像功能基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了400-1200 nm寬光譜暗場(chǎng)與熒光信號(hào)的采集與成像、單個(gè)30 nm粒徑納米金顆粒1 ms時(shí)間高采集速度的多模式成像功能。熒光成像與暗場(chǎng)成像相互補(bǔ)充，可實(shí)現(xiàn)對(duì)納米金顆粒與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)共定位功能成像。

3.2 暗場(chǎng)信號(hào)采集與成像性能的提升

暗場(chǎng)顯微鏡成像收集得到的信號(hào)通常與樣品的散射和照明光源強(qiáng)度相關(guān)。在本系統(tǒng)中，通過(guò)引入具有高照明光源強(qiáng)度的超連續(xù)激光器，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)散射信號(hào)較弱的樣品光譜的快速采集。

首先，為了驗(yàn)證光片模式下暗場(chǎng)成像效果的提升，我們分別使用了70 nm邊長(zhǎng)的納米金三角片和50 nm粒徑的納米金球顆粒作為研究對(duì)象(圖2)。兩者的形貌使用透射電子顯微鏡進(jìn)行了表征(圖2a，b)。圖2c是用普通鹵素?zé)糇鳛楣庠磳?duì)納米金三角片的暗場(chǎng)成像結(jié)果(曝光時(shí)間100 ms，ISO靈敏度為400，鹵素?zé)粽彰鲝?qiáng)度100%，輸出為DC 12 V 8.4 A)，分析后表明信號(hào)極其微弱。與之相反，圖 2e顯示在超連續(xù)激光暗場(chǎng)光片照明模式下(曝光時(shí)間100 ms，ISO靈敏度為400，照明強(qiáng)度20%，實(shí)測(cè)照明功率5.7 mW)，在大視野下可清晰地觀察到單個(gè)70 nm納米金三角片獨(dú)有的紅色特征峰的散射信號(hào)。對(duì)50 nm納米金球的表征反映了同樣的結(jié)果(圖2d，f)。在相同的曝光時(shí)間下(100 ms)，利用超連續(xù)激光使用光片照明，通過(guò)比較綠色特征峰的散射信號(hào)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表S1、S2，Supporting Information)，其信噪比相較于鹵素?zé)粽彰魈岣吡?100倍(圖 2g，計(jì)算方法見(jiàn) Supporting Information)。以上結(jié)果證明，我們自行搭建的超連續(xù)激光暗場(chǎng)成像系統(tǒng)在成像效果方面有了顯著提升。

圖2 超連續(xù)激光光源顯著提高納米金的信號(hào)強(qiáng)度Fig. 2 The contrast of the Signal intensity before and after improvement.

然后，我們將光片照明模式切換至聚焦模式來(lái)實(shí)現(xiàn)更大光強(qiáng)照明，提高光譜采集速度，借此實(shí)現(xiàn)對(duì)更小顆粒的快速信號(hào)采集，達(dá)到對(duì)納米金屬單顆粒進(jìn)行實(shí)時(shí)光譜分析的目的。在對(duì)某一特定單顆粒進(jìn)行光譜測(cè)量時(shí)，在聚焦模式下，通過(guò)嚴(yán)格控制照明光斑的形狀來(lái)實(shí)現(xiàn)照明中心的高強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)在極短時(shí)間內(nèi)收集到足夠強(qiáng)的光譜信號(hào)。圖3是在聚焦模式下獲得的30 nm納米金顆粒與40 nm納米銀顆粒的暗場(chǎng)成像信息與光譜數(shù)據(jù)。相對(duì)于光片照明，聚焦式照明的散射信號(hào)強(qiáng)度有了明顯提升。在實(shí)測(cè)照明總功率170.1 μW、曝光時(shí)間100 ms的條件下，納米金顆粒(圖3a)與納米銀顆粒(圖3c)具有很強(qiáng)的散射信號(hào)，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重過(guò)曝現(xiàn)象。對(duì)兩者進(jìn)行光譜分析(圖3b，d)，確定了納米金顆粒在540 nm、納米銀顆粒在480 nm有強(qiáng)散射特征峰。

圖3 多模式暗場(chǎng)聚焦模式成像Fig. 3 Imaging of Multi-mode DFM in focus illumination mode.

圖4 聚焦模式暗場(chǎng)測(cè)得30 nm金在不同曝光時(shí)間下的光譜信息Fig. 4 The spectrums of 30 nm gold nanoparticles with different exposure times measured in focus illumination mode.

在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步優(yōu)化曝光時(shí)間，來(lái)獲得更快的時(shí)間分辨率，從而進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像。我們對(duì)30 nm的納米金在聚焦模式照明下進(jìn)行光譜分析，曝光時(shí)間分別為1、5、15、25 ms，如圖4所示。結(jié)果顯示，在聚焦模式下僅需1 ms的曝光時(shí)間就足以獲得完整的光譜信息，其特征峰與長(zhǎng)時(shí)間曝光所得數(shù)據(jù)保持一致，這為觀察納米金屬顆粒的動(dòng)態(tài)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。超高的時(shí)間分辨率可以及時(shí)捕捉生化事件的動(dòng)態(tài)信息，極大的降低動(dòng)態(tài)追蹤過(guò)程中重要信息和事件的丟失率。通過(guò)檢測(cè)光譜的實(shí)時(shí)變化可以判斷納米金的聚集狀態(tài)以及實(shí)時(shí)變化過(guò)程。

圖5 多模式暗場(chǎng)在生物分析的應(yīng)用Fig. 5 Application of the Multi-mode DFM in bioresearch.

3.3 多模式成像用于實(shí)際生物分析

該系統(tǒng)除了暗場(chǎng)模式，通過(guò)激發(fā)與發(fā)射濾塊的組合與切換，還能同時(shí)提供熒光成像模式來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光與納米金散射圖像的共定位，這為納米金顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位提供了依據(jù)。

圖5為利用暗場(chǎng)成像模式和熒光成像兩種模式來(lái)觀察金納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。圖5a是用Cy3標(biāo)記獲得的溶酶體熒光成像結(jié)果，5b為暗場(chǎng)成像模式下納米金顆粒的分布信息，5c是二者的共定位。從中可以看出，溶酶體和納米金有很好的共定位，初步反映納米金進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被溶酶體吞噬。此外，我們還對(duì)納米金顆粒進(jìn)行了實(shí)時(shí)追蹤檢測(cè)(見(jiàn)Supporting Information中的視頻)，可以通過(guò)其顏色與光譜的變化，觀察納米金的聚集過(guò)程。在整個(gè)追蹤過(guò)程中，暗場(chǎng)中首先觀察到初始的綠色亮點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，表明單顆粒在進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生了聚集，這可能反映了納米金被溶酶體所吞噬。然后，又轉(zhuǎn)變?yōu)閱晤w粒納米金所具有的綠色，這有可能是被溶酶體吞噬后又重新在胞內(nèi)釋放的結(jié)果。由此可見(jiàn)，改造后的多模式全光譜暗場(chǎng)顯微鏡既具有超高的時(shí)間分辨率，又具有熒光顯微鏡功能成像共定位的能力。通過(guò)對(duì)納米金等具有LSPR特性的探針進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)檢測(cè)，我們可以對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)里的生物生化反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行追蹤和分析，為研究納米材料與細(xì)胞的相互作用提供了有力手段。

4 結(jié)論

本文通過(guò)引入超連續(xù)光譜激光器，改變照明模式等對(duì)暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行改造，提高了暗場(chǎng)成像光源的亮度與光譜的范圍，大大提高單顆粒光譜采集的時(shí)間分辨率，拓展了光譜采集的波長(zhǎng)范圍。在對(duì)納米金的檢測(cè)效果上，顯著提高了納米金的信號(hào)強(qiáng)度、檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)速度。相較于改造之前的暗場(chǎng)-光譜儀聯(lián)用顯微鏡，我們獲得了高于鹵素?zé)粽彰?4個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)，可以檢測(cè)到尺寸低至30 nm的納米金顆粒、數(shù)目低至單個(gè)顆粒的光譜，同時(shí)可以將全光譜采集時(shí)間從100 ms縮短至1 ms。該體系可以顯著降低動(dòng)態(tài)追蹤過(guò)程中重要信息和事件的丟失率，可以滿足實(shí)時(shí)研究生物體內(nèi)的生化反應(yīng)的需求，例如，蛋白-蛋白相互作用、核酸-蛋白相互作用等32-37。同時(shí)保留了暗場(chǎng)成像可長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)追蹤的優(yōu)勢(shì)。該成像系統(tǒng)可以更精確地用于細(xì)胞內(nèi)單顆粒的動(dòng)態(tài)追蹤，為生物學(xué)基礎(chǔ)研究與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供有力的工具。同時(shí)我們還在商業(yè)暗場(chǎng)顯微鏡上實(shí)現(xiàn)了熒光成像和暗場(chǎng)成像的聯(lián)用，并用該系統(tǒng)證明了納米金進(jìn)入細(xì)胞后定位在溶酶體內(nèi)部。該系統(tǒng)的成功搭建為研究納米材料與細(xì)胞的相互作用提供了有力手段。

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