李明 楊新平 敖績逃 謝春 盧玉華 賴若梅 彭弘 敖志文

1江西省宜春市人民醫(yī)院血液科（江西宜春336000）；2江西省萬載縣人民醫(yī)院內(nèi)三科（江西萬載336100）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。╟entral nervous system leukemia，CNSL）是導(dǎo)致治療失敗和影響AML預(yù)后的重要因素，由于“血-腦脊液屏障”的存在，髓外殘留的白血病細(xì)胞則成為白血病復(fù)發(fā)的根源。因此對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的檢測和預(yù)測就具有重要的臨床意義。研究表明FLT3基因在約70%～100%的各種FAB亞型急性髓系白血?。ˋML）患者中存在表達(dá)［1-2］；在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、骨髓增生異常綜合征和慢性粒細(xì)胞白血病（CML）急性變患者中也存在不同程度的表達(dá)；在各種髓系白血病細(xì)胞株和淋巴瘤細(xì)胞株中也存在FLT3基因的表達(dá)［3-4］。現(xiàn)階段臨床上診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病常采用腦脊液的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)的檢測方法，但存在細(xì)胞形態(tài)學(xué)敏感性低，而流式細(xì)胞學(xué)特異性差的特點，基于上述FLT3基因的表達(dá)特點，本研究則采用檢測腦脊液中FLT3基因表達(dá)情況診斷和預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，探索一種更敏感更特異的檢測手段和預(yù)測指標(biāo)。

1 對象和方法

1.1 研究對象標(biāo)本來自宜春市人民醫(yī)院血液科2013年3月到2017年12月期間住院的46例AL患者，所有患者診斷均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)、第三版》［5］。46例AL患者中男29例，女17例，中位年齡47.5歲（19～65歲），AML 28例，ALL 18例，在這46例AL患者中包括完全緩解（CR）期AL 35例，以CNSL為首發(fā)癥狀的AL 7例，按FAB分型為M41例M52例，B-ALL3例，T-ALL 1例，病程中出現(xiàn)CNSL患者4例，按FAB分型為M31例，B-ALL2例，T-ALL 1例，另外同期住院非血液病及腫瘤性疾病腦脊液正常者10例作為正常對照組，男7例，女3例，中位年齡57歲（22～70歲）。對于部分患者連續(xù)追蹤6～8個療程以進(jìn)行基因表達(dá)的動態(tài)監(jiān)測。

1.2 治療方案及療效標(biāo)準(zhǔn)CR期AL患者化療前常規(guī)進(jìn)行CNSL的篩查和鞘注給藥預(yù)防，出現(xiàn)CNSL患者每周行腰穿鞘注給藥2次，直至癥狀緩解和腦脊液恢復(fù)正常，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)、第三版》。

1.3 標(biāo)本采集及檢測明確診斷后，在進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病預(yù)防時收集腦脊液2～4 mL，另外所有患者均在化療前以肝素或EDTA管抗凝采集骨髓和外周血3～5 mL，對采集的腦脊液、骨髓和外周血樣本分別應(yīng)用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，對腦脊液及外周血乳酸脫氫酶（LDH）采用SIEMENS ADVIA 2400生化分析儀速率法檢測。

1.4 引物FLT3目的片段大小210 bp，P1：5′-TCAAGTGCTGTGCATACAATTCCC-3，P2：5′-CACCTGTACCATCTGTAGCTGGCT-3′；GAPDH 目的片段大小570 bp，序列P1：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，P2：5′-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3′

1.5 cDNA合成采用EasyScriptTwo-Step RTPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行cDNA合成（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：AH401-01）

1.6 PCR反應(yīng)按照試劑盒推薦的反應(yīng)條件及體系進(jìn)行，反應(yīng)體系共20 μL，共進(jìn)行33個循環(huán)。

1.7 PCR產(chǎn)物分析取等量的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，采用Quantityone4.4軟件進(jìn)行分析，取FLT3/GAPDH比值代表FLT3mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗；計量數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，采用獨立樣本的t檢驗；多組計量資料比較采用Z檢驗；相關(guān)性分析采用spearman秩相關(guān)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLT3基因表達(dá)AL患者腦脊液中FLT3基因表達(dá)情況CNSL組腦脊液FLT3基因表達(dá)陽性率高于CR期患者及對照組。見表1、圖1。

表1 腦脊液中FLT3基因表達(dá)情況Tab.1 Expression of FLT3 gene in cerebrospinal fluid例

圖1 腦脊液中FLT3基因RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of FLT gene RT-PCRproducts in cerebrospinal fluid

2.2 FLT3陽性組和陰性組患者的腦脊液單個核細(xì)胞總數(shù)比較腦脊液FLT3陽性組中單個核細(xì)胞總數(shù)為（0.001～0.8）×109/L，均值0.223 8，F(xiàn)LT3陰性組中單個核細(xì)胞總數(shù)為（0.001～0.5）×109/L，均值0.088 36，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.737，P＜0.05），見圖2。

圖2 FLT3陽性組與陰性組腦脊液單個核細(xì)胞總數(shù)比較Fig.2 Comparison of cerebrospinal fluid mononuclear cells in FLT3 positive group and negative group

2.3 不同組AL患者腦脊液中FLT3表達(dá)水平比較CNSL組中FLT3表達(dá)水平顯著高于CR組和對照組。見表2。

表2 不同組患者FLT3表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of FLT3 expression levels in different groups

2.4 腦脊液FLT3表達(dá)與骨髓及外周血FLT3基因表達(dá)情況比較對12例腦脊液FLT3陽性患者的骨髓和外周FLT3表達(dá)水平進(jìn)行分析并比較之間的相關(guān)性，骨髓FLT3表達(dá)水平為（0～0.786 4），中位0.504 3，外周血FLT3表達(dá)水平為（0～0.527 5）中位數(shù)0.312 4，3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 12例患者腦脊液FLT3表達(dá)水平與骨髓和外周血FLT3表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of FLT3 expression levels in cerebrospinal fluid and FLT3 expression in bone marrow and peripheral blood in 12 patients

2.5 CNSL患者腦脊液中FLT3表達(dá)水平與腦脊液壓力、腦脊液常規(guī)生化指標(biāo)的關(guān)系腦脊液中FLT3表達(dá)水平與腦脊液生化指標(biāo)及腦脊液壓力無相關(guān)性（P＞0.05）。見表4。

表4 11例CNSL患者腦脊液中FLT3表達(dá)水平與腦脊液生化之間的關(guān)系Tab.4 Relationship between FLT3 expression level and cerebrospinal fluid biochemistry index in cerebrospinal fluid of 11 patients with CNSL

2.6 腦脊液FLT3表達(dá)水平與腦脊液LDH水平比較對12例FLT3基因陽性腦脊液檢測了其LDH水平并分析之間的相關(guān)性，LDH水平為：（13.269±9.0433）U/L，spearman相關(guān)系數(shù)0.90（P=0.001），見圖3。

2.7 CNSL患者腦脊液中FLT3表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系比較了腦脊液中FLT3表達(dá)水平與年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)、外周血LDH水平、骨髓CD34及HLA-DR表達(dá)率的相關(guān)性（P＞0.05）。見表5。

2.8 動態(tài)監(jiān)測腦脊液FLT3表達(dá)對26例患者的腦脊液FLT3表達(dá)情況均進(jìn)行了4～8個療程的動態(tài)監(jiān)測，15例CR期患者腦脊液FLT3表達(dá)陰性，隨訪期間均無CNSL發(fā)生，但其中出現(xiàn)2例FLT3陽性表達(dá)（0.318 6、0.254 9），腦脊液常規(guī)檢查正常，隨后6個療程監(jiān)測FLT3表達(dá)均為陰性，也未出現(xiàn)CNSL，1例M3維持治療期間出現(xiàn)頭痛、腦脊液蛋白和細(xì)胞數(shù)水平升高，符合CNSL診斷，F(xiàn)LT3為陽性表達(dá)，多次腰穿鞘注治療后FLT3表達(dá)轉(zhuǎn)陰，隨訪2年均處于緩解狀態(tài)。

圖3 腦脊液LDH水平和FLT3表達(dá)水平相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between LDH levels and FLT3 expression levels in cerebrospinal fluid

表5 腦脊液FLT3表達(dá)水平與患者年齡、外周血白細(xì)胞、LDH及骨髓免疫表型的關(guān)系Tab.5 Relationship between expression of FLT3 in cerebrospinal fluid and age，peripheral blood leukocytes，LDH，bone marrow immunophenotype

11例CNSL患者，10例FLT3表達(dá)陽性，中位表達(dá)水平為0.7065，經(jīng)抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病治療后，表達(dá)水平轉(zhuǎn)陰，CNSL癥狀消失，1例伯基特淋巴瘤白血病患者多次FLT3表達(dá)均陰性。

3 討論

人FLT3基因是Ⅲ型受體酪氨酸激酶的編碼基因，GIACOMO等［5］證實骨髓中FLT3主要表達(dá)于CD34十干/祖細(xì)胞中，處于G0期的細(xì)胞多不表達(dá)，因而FLT3基因在正常人骨髓中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，外周血中不表達(dá)。研究證實FLT3基因的活化和過度表達(dá)與急性白血病惡性克隆的增殖和維持相關(guān)，且在白血病中的表達(dá)顯著高于其他類型的腫瘤和細(xì)胞系，尤其是在急性髓系白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)明顯上調(diào)錯誤。OZEKI等［8］，AML患者骨髓中CD34+陽性率與FLT3表達(dá)水平之間無明顯相關(guān)性，F(xiàn)LT3的表達(dá)水平與CD34+細(xì)胞數(shù)比例不一致，提示FLT3的過度表達(dá)并不是由CD34+細(xì)胞數(shù)增加引起，而是白血病細(xì)胞一種異常表達(dá)狀態(tài)，F(xiàn)LT3基因過度表達(dá)及活化又與急性白血病的發(fā)生密切相關(guān)，因此檢測和監(jiān)測FLT3基因的這種異常表達(dá)對AL患者就顯的尤為重要而且更有意義。多項研究顯示急性白血病患者骨髓及外周血中FLT3基因高表達(dá)常提示預(yù)后差、易復(fù)發(fā)，是預(yù)后不良和MRD監(jiān)測的指標(biāo)［9-11］，但FLT3基因在腦脊液中的表達(dá)及臨床意義尚不明確，基于白血病中FLT3基因上述表達(dá)特點，本研究檢測了AL患者腦脊液中FLT3表達(dá)情況，結(jié)果顯示CNSL患者FLT3陽性率及表達(dá)水平均顯著高于CR組及對照組患者，未發(fā)生CNSL患者腦脊液中FLT3基因表達(dá)多為陰性，通過對比分析外周血及骨髓FLT3基因表達(dá)水平情況，腦脊液FLT3表達(dá)與外周血及骨髓FLT3表達(dá)無相關(guān)性，而且多數(shù)研究也顯示FLT3基因在AML、ALL有廣泛的高表達(dá)，且骨髓和外周血表達(dá)率及表達(dá)水平無差異性，是預(yù)后差，易復(fù)發(fā)的指標(biāo)［10，12］，提示CNSL患者腦脊液中FLT3基因的表達(dá)是一種獨立的異常表達(dá)狀態(tài)。

FLT3基因存在高表達(dá)及突變的患者常伴有外周血高白細(xì)胞、骨髓原始細(xì)胞比例高、緩解率低及易感染等特點［9，13］。CHENG 等［14］分析了 395 例AML患者，發(fā)生CNSL的患者約占5.1%，CNSL的發(fā)生與性別、血清LDH水平、血紅蛋白及免疫表型無相關(guān)性，其年齡＜45歲、高白細(xì)胞數(shù)、M4及11q23異常是CNSL的高風(fēng)險因素。本研究也比較了腦脊液FLT3基因表達(dá)水平與患者年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)、腦脊液常規(guī)生化及免疫表型之間的關(guān)系，結(jié)果顯示腦脊液FLT3表達(dá)水平與上述因素?zé)o相關(guān)性。但對FLT3陽性組與陰性組腦脊液單個核細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了比較，F(xiàn)LT3陽性組單個核細(xì)胞數(shù)高于陰性組患者，同時對腦脊液LDH水平與FLT3表達(dá)的分析顯示，腦脊液FLT3陽性患者有更高的LDH水平，由于白血病細(xì)胞的增殖較快，糖酵解產(chǎn)生LDH的量超過正常組織，引起腦脊液中的LDH酶水平增加。另外FLT3基因活具有促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖和維持的功能，F(xiàn)LT3過度表達(dá)致酪氨酸激酶（RTK）持續(xù)激活，使RTK二聚體化，激酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，酪氨酸殘基磷酸化，激活一系列信號轉(zhuǎn)錄途徑如P13K、STAT5、RAS/MAPK及PI3K途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖，白血病細(xì)胞凋亡受抑。這些都可能是FLT3高表達(dá)患者腦脊液單個核細(xì)胞數(shù)更高的原因之一。NAEL等［15］對55例合并有CNSL的患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清高LDH、FLT3高表達(dá)及存在ITD和或NPM1突變、復(fù)雜核型是CNSL的高危因素，在初診患者中易發(fā)生CNSL，預(yù)后差。JABBOUR等［16］也對1325例難治復(fù)發(fā)AML患者的分析也顯示，年齡、高LDH、FLT3基因突變及功能狀態(tài)是CNSL的獨立危險因素，因此這也進(jìn)一步提示FLT3基因表達(dá)與中樞神經(jīng)系白血病的發(fā)生密切相關(guān)。另外本研究中有2例在CR期患者中出現(xiàn)了FLT3陽性表達(dá)，為髓系白血病，但表達(dá)水平較低，腦脊液常規(guī)檢查正常，隨后6個療程監(jiān)測FLT3表達(dá)均為陰性，也未出現(xiàn)CNSL，這2例患者也有可能已經(jīng)出現(xiàn)中樞侵犯，有白血病細(xì)胞通過血腦屏障進(jìn)入到腦脊液中，但是由于數(shù)量較少，不能由腦脊液常規(guī)檢測檢出，并發(fā)CNSL是預(yù)后不良的因素因此在臨床治療過程中更有意識性的強(qiáng)化了對CNSL的預(yù)防和治療，導(dǎo)致隨后未發(fā)生CNSL。通過動態(tài)監(jiān)測腦脊液中FLT3表達(dá)情況，F(xiàn)LT3表達(dá)由陽轉(zhuǎn)陰是治療有效的指標(biāo)，F(xiàn)LT3表達(dá)持續(xù)陽性提示白血病細(xì)胞持續(xù)存在，需要強(qiáng)化對CNSL的治療，腦脊液的細(xì)胞學(xué)檢查作為這類疾病當(dāng)前臨床檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性較低、特異性差，鑒于FLT3在腦脊液中的上述表達(dá)規(guī)律，可以作為一種獨立的診斷及預(yù)測指標(biāo)，因此通過檢測腦脊液FLT3基因表達(dá)可以早期發(fā)現(xiàn)和提示CNSL，但是由于FLT3基因的主要功能是調(diào)節(jié)早期前體細(xì)胞及不成熟淋巴細(xì)胞的生長，越早期淋巴細(xì)胞其FLT3表達(dá)率越高，在成熟TB淋巴細(xì)胞腫瘤中表達(dá)率低［17］，同時也觀察到1例伯基特淋巴瘤白血病并發(fā)CNSL患者，多次FLT3基因表達(dá)均陰性，因此FLT3基因在AML并發(fā)的CNSL中的意義可能更大。但本研究中樣本量較少，且半定量RT-PCR檢測的精確度欠佳，以及大部分病例隨訪時間較短，因此FLT3基因的臨床應(yīng)用價值尚需更多研究來探討。

綜上所述腦脊液FLT3基因表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)水平的改變可以作為一種更為敏感的檢測方法和療效判斷指標(biāo)，為臨床提供一種新思路和新方法。