衷雪梅 金萱

1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院（南昌330006）；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院輔助生殖中心（南昌330006）

卵泡液抗苗勒氏管激素（AMH）、激活素A（Activin A）、骨形成蛋白（BMP-15）屬轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族，是卵源性因子、分別由卵泡顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞分泌，對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞增殖都有意義。從始基卵泡階段到排卵至黃體形成期，它們參與協(xié)調(diào)卵泡的招募、選擇和發(fā)育成熟，甚至與多種卵巢疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［1］。在輔助生殖技術(shù)（ART）應(yīng)用中，AMH濃度可以反映女性原始卵泡的庫存情況，是評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的可靠指標(biāo)［2］。研究發(fā)現(xiàn)BMP-15調(diào)控卵母細(xì)胞質(zhì)量，并且與控制性超促排卵（COH）卵巢反應(yīng)性相關(guān)［3-4］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Activin A能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育、減少閉鎖卵泡的比例［5］。目前ART研究中多為血清AMH濃度對(duì)卵巢反應(yīng)性的影響，BMP-15和Activin A的研究集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚缺乏卵泡液因子對(duì)卵巢反應(yīng)性及臨床妊娠結(jié)局影響的研究。本研究旨在分析黃體中期長方案中各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)卵巢反應(yīng)及臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值，試圖為AMH、BMP-15、Activin A與COH過程中卵巢發(fā)應(yīng)性及妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2017年9月至2018年1月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院輔助生殖中心行IVF/ICSIET治療的患者，共計(jì)155個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～40歲；（2）促排卵方案采用黃體期長方案；（3）無基礎(chǔ)卵巢疾??；（4）甲狀腺、腎上腺等未見明顯異常；（5）基礎(chǔ)FSH≤12IU/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多囊卵巢綜合征、卵巢功能不全；（2）子宮畸形、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜異位癥；（3）既往有結(jié)核病史，或有Cushing綜合癥、垂體腫瘤和糖尿病等其他系統(tǒng)疾病。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)獲卵數(shù)分組，（1）低反應(yīng)組：獲卵數(shù)≤ 4個(gè)；（2）正常反應(yīng)組：5 ～ 15個(gè)；（3）高反應(yīng)組：＞15個(gè)。將新鮮移植周期按年齡（＜35歲）分組［6］，根據(jù)妊娠情況分妊娠組和未妊娠組。

1.3 方法

1.3.1 黃體中期長方案促排卵于前一個(gè)月經(jīng)周期黃體中期開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（Gonadaotropin releasing hormoneagonist，GnRH-a）（達(dá)必佳德國輝凌）進(jìn)行降調(diào)節(jié)，月經(jīng)來潮的第3 ～ 5天復(fù)診，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)［7］（降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)：陰道B超檢測(cè)卵泡直徑≤5 mm，子宮內(nèi)膜＜5 mm；血清雌激素（E2）＜30 pg/mL黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、FSH ＜ 5 IU/L，）后開始使用Gn促排，劑量為75～300 IU/d，根據(jù)患者年齡、體重、血清基礎(chǔ)性激素水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)及以往治療周期的卵巢反應(yīng)性進(jìn)行調(diào)整。超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，同時(shí)監(jiān)測(cè)血E2、P、LH、FSH水平來調(diào)節(jié)Gn劑量。當(dāng)雙側(cè)卵巢內(nèi)有1個(gè)及以上卵泡平均直徑達(dá)18 mm或3個(gè)及以上卵泡平均直徑達(dá)17 mm時(shí)，結(jié)合血清性激素水平，停藥，于當(dāng)晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）（艾澤瑞士默克雪蘭諾），36～38 h后行陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。

1.3.2 標(biāo)本采集和處理取卵日留取患者第一管卵泡液（卵泡平均直徑≥17 mm，且無明顯血染的卵泡液納入研究），經(jīng)3 000 r/min離心（TGL-168上海安亭科技儀器廠）10 min后，取上清液留置于Eppendorf離心管，標(biāo)記后-80℃保存待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA法試劑盒（BioVision美國），對(duì)155例患者的卵泡液中Activin A、Bmp-15、AMH蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 胚胎評(píng)分及妊娠結(jié)局判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)本中心胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，選擇2枚2PN發(fā)育而來的優(yōu)質(zhì)胚胎移植（優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：卵裂球數(shù)目6～8個(gè)，碎片≤10%，卵裂球無明顯大小差異的胚胎）；若無優(yōu)質(zhì)胚胎，則選擇可移植胚胎［可移植胚胎標(biāo)準(zhǔn)：第3天的4細(xì)胞Ⅱ級(jí)以上或6細(xì)胞Ⅲ級(jí)以上的胚胎］。剩余可利用胚胎取得患者知情同意后行玻璃化冷凍，發(fā)育緩慢的胚胎再培養(yǎng)至第5～6天，形成囊胚后行玻璃化冷凍。移植胚胎后14 d及17 d分別測(cè)定血清hCG值，當(dāng)hCG為陽性時(shí)確定生化妊娠；移植后28 d腹部超聲檢查見孕囊確定為臨床妊娠。

1.3.5 觀察指標(biāo)基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（antral folliclecount，AFC）于月經(jīng)來潮第2～3天經(jīng)陰道超聲測(cè)定雙側(cè)卵巢卵泡平均直徑2～10 mm之和。IVF總受精率=（2PN卵子數(shù)+1PN卵子數(shù)+多PN卵子數(shù)+0PN卵裂卵子數(shù)）/IVF加精卵子總數(shù)×100%；ICSI總受精率=（2PN卵子數(shù)+1PN卵子數(shù)+多PN卵子數(shù)）/注射MII期卵子總數(shù)×100%；β-hCG陽性率=β-hCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)（ANOVA），若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。使用Logistic回歸分析法分析影響卵巢反應(yīng)和臨床妊娠結(jié)局的因素，同時(shí)構(gòu)建患者受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）確定cut-off值以評(píng)估各預(yù)測(cè)指標(biāo)價(jià)值，當(dāng)ROC曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve，AUC）＞0.9時(shí)有最佳預(yù)測(cè)價(jià)值，在0.7～0.9時(shí)有預(yù)測(cè)價(jià)值，在0.5～0.7時(shí)預(yù)測(cè)價(jià)值較低。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征共納入155例患者，其中低反應(yīng)組14例，正常反應(yīng)組93例，高反應(yīng)組48例；新鮮周期移植者共93例，＜35歲患者70例。

2.2 不同卵巢反應(yīng)患者臨床資料和卵泡液檢測(cè)指標(biāo)的比較不同卵巢反應(yīng)的患者，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）無差異；年齡、基礎(chǔ)AFC、基礎(chǔ)FSH不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Gn總量與獲卵數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），卵巢反應(yīng)性越高，Gn總量越低，獲卵數(shù)越多。卵泡液（follicular fluid，F(xiàn)F）Activin A、AMH水平均無差異，低反應(yīng)組與高反應(yīng)組卵泡液BMP-15水平均高于正常反應(yīng)組。IVF/ICSI總受精率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高反應(yīng)組受精率最高。在新鮮周期移植的患者中，高反應(yīng)組臨床妊娠率高于低反應(yīng)組，均明顯高于正常反應(yīng)組。見表1。

表1 不同卵巢反應(yīng)患者臨床資料和卵泡液檢測(cè)指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of clinical data and follicular fluid detection indexes in patients with different ovarian response x±s

2.3 年齡＜35歲不同妊娠結(jié)局患者臨床資料和卵泡液檢測(cè)指標(biāo)的比較妊娠組與未妊娠組BMI、基礎(chǔ)AFC、Gn總使用劑量均無差異；妊娠組FFAMH、FFBMP-15、FFActivin A水平高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；妊娠組獲卵數(shù)、IVF總受精率高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 年齡＜35歲患者臨床資料和卵泡液檢測(cè)指標(biāo)Tab.2 Clinical data and follicular fluid test indicators for patients＜35 years x±s

表2 年齡＜35歲患者臨床資料和卵泡液檢測(cè)指標(biāo)Tab.2 Clinical data and follicular fluid test indicators for patients＜35 years x±s

項(xiàng)目BMI（kg/m2）基礎(chǔ)AFC（個(gè)）基礎(chǔ)FSH（IU/L）卵泡液AMH（pg/mL）卵泡液BMP-15（pg/mL）卵泡液Activin A（ng/L）Gn總量（IU）獲卵數(shù)（個(gè)）IVF總受精率（%）ICSI總受精率（%）妊娠（n=30）21.4±2.8 14.2±3.9 7.0±2.0 841.9±108.8 32.3±8.1 70.5±24.0 2 603.3±1 079.4 13.4±5.0 87.8（184/221）78.7（118/150）未妊娠（n=40）21.3±2.0 12.7±4.2 7.7±1.5 730.0±135.3 23.3±10.5 82.7±25.7 2 603.1±824.4 11.2±4.1 77.2（268/347）84.9（62/73）P值0.869 0.115 0.102 0.000 0.000 0.048 0.999 0.041 0.002 0.285

2.4 預(yù)測(cè)價(jià)值分析

2.4.1 與卵巢反應(yīng)性和年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局相關(guān)的因素分析根據(jù)ANOVA分析的結(jié)果，采用多元有序Logistic回歸分析可能對(duì)卵巢反應(yīng)性產(chǎn)生影響的因素，校正混雜因素后顯示，獲卵數(shù)是影響卵巢反應(yīng)性的獨(dú)立因素，見表3。采用二元Logistic回歸分析評(píng)估可能對(duì)年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響的因素，校正混雜因素后顯示，F(xiàn)FAMH、FFBMP-15是影響年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素，見表3。

表3 卵巢反應(yīng)性及＜35歲患者妊娠結(jié)局Logistic回歸分析Tab.3 The logistic regression analysis of ovarian responsiveness and pregnancy outcome in patients＜35 years

2.4.2 相關(guān)因素對(duì)年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線對(duì)比分析顯示，F(xiàn)FBMP-15對(duì)妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)的AUC（曲線下面積）為0.76，臨界值為27.26、靈敏度和特異度分別為73%和72%，Youden指數(shù)為0.46；FFAMH對(duì)妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)的AUC為0.748，臨界值為736.8、靈敏度和特異度分別為87%和65%，Youden指數(shù)為0.52。FFBMP-15和FFAMH均是臨床妊娠結(jié)局（＜35歲）的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)，F(xiàn)FBMP-15對(duì)妊娠的預(yù)測(cè)價(jià)值高于FFAMH對(duì)妊娠的預(yù)測(cè)價(jià)值。見表4。

3 討論

女性個(gè)體的生殖力與卵泡發(fā)育密切相關(guān)，卵巢反應(yīng)受卵巢儲(chǔ)備功能等影響，臨床妊娠的成功又有胚胎、子宮內(nèi)膜及生殖內(nèi)分泌共同作用。研究［8，10］表明卵泡顆粒細(xì)胞分泌 AMH、Activin A，AMH在初級(jí)至竇狀卵泡都有表達(dá)、抑制始基卵泡激活，敲除AMH基因后會(huì)加速始基卵泡池的耗竭；Activin A促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、分化和卵母細(xì)胞生長，但增加卵泡凋亡［9］。BMP-15由卵母細(xì)胞特異分泌，促進(jìn)卵泡及卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，與胚胎發(fā)育正相關(guān)［3，8，11-12］。研究［1］表示卵巢局部因子，生長因子等調(diào)節(jié)失衡可能是影響卵巢反應(yīng)甚至是妊娠結(jié)局的因素。研究［3-4，11］發(fā)現(xiàn)FFBMP-15水平與卵母細(xì)胞成熟、胚胎受精及發(fā)育有關(guān)，與卵巢反應(yīng)性也相關(guān)；血清AMH是反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能的最敏感指標(biāo)［15］，既往研究表明［16］在拮抗劑方案中AMH對(duì)卵巢低反應(yīng)及高反應(yīng)有預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究顯示FFAMH水平在卵巢反應(yīng)組間無明顯差異；低、高反應(yīng)組FFBMP-15水平均高于正常反應(yīng)組，與卵巢反應(yīng)性相關(guān)（P＜0.05），但FFBMP-15并非是影響卵巢反應(yīng)的獨(dú)立因素。與既往研究不一致［17］，本研究結(jié)果顯示，年齡、基礎(chǔ)AFC和基礎(chǔ)FSH在不同卵巢反應(yīng)患者中有組間差異，但均不能作為影響卵巢功能的獨(dú)立因素，這可能與Logistic回歸模型建立有關(guān)，既往多是卵巢低反應(yīng)與正常反應(yīng)的比對(duì)。

表4 相關(guān)因素對(duì)年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.4 The predictive value of relevant factors for pregnancy outcome in patients＜35 years

近來關(guān)于AMH能否預(yù)測(cè)臨床妊娠結(jié)局一直存在爭議［18-20］，最新發(fā)現(xiàn)Gn第5天血清AMH濃度亦可作為預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的指標(biāo)［21］；同樣FFAMH是否能作為妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)指標(biāo)也存在爭議［22-24］。本研究結(jié)果顯示＜35歲妊娠組患者FFAMH濃度高于未妊娠組（P＜ 0.001），AUC為0.748，表明FFAMH是預(yù)測(cè)＜35歲患者妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素，這與最近研究一致［6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［13-14］研究表明BMP-15體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟，IVF-ET后產(chǎn)仔率提高；本研究發(fā)現(xiàn)＜35歲患者妊娠組FFBMP-15濃度高于未妊娠組（P＜0.001），AUC為0.760，F(xiàn)FBMP-15是預(yù)測(cè)年妊娠結(jié)局（＜35歲）的獨(dú)立因素。既往研究［25-26］表明Activin A是早期稽留流產(chǎn)的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示＜35歲患者妊娠組FFActivin A濃度低于未妊娠組（P=0.048），但Activin A不是影響妊娠結(jié)局（＜35歲）的獨(dú)立因素，是否說明卵泡液Activin A的表達(dá)與妊娠無關(guān)，只與早期卵泡發(fā)育有關(guān)。因樣本量關(guān)系，本研究只分析了年齡＜35歲患者妊娠結(jié)局的影響因素，對(duì)于≥35歲患者的研究有待收集更多的標(biāo)本后進(jìn)一步分析。

綜上所述，在黃體中期長方案中，F(xiàn)FBMP-15和FFAMH是年齡＜35歲妊娠結(jié)局的有效獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)；FFBMP-15在不同卵巢反應(yīng)的組間表達(dá)有差異，也為BMP-15與卵巢發(fā)應(yīng)的相關(guān)性研究提供了新的思路。受條件所限，本研究樣本量較小，且相關(guān)血清指標(biāo)未全面檢測(cè)，所以血清和卵泡液指標(biāo)與卵巢反應(yīng)及妊娠結(jié)局的相關(guān)性還需擴(kuò)大樣本量深入研究證實(shí)。