陳 思 周 催 余輝艷 陶領偉 王玉珊 肖 榮

(首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系 環(huán)境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069)

由于外周循環(huán)中的膽固醇無法直接通過血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)進入腦內，腦內的膽固醇主要由星形膠質細胞合成并與膽固醇載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)結合形成膽固醇-ApoE復合物[1]。膽固醇-ApoE復合物被運送到神經(jīng)細胞溶酶體中，由尼曼匹克蛋白質(Niemann-Pick C protein，NPC)實現(xiàn)膽固醇在溶酶體中的轉運。NPC2蛋白質首先與膽固醇的烷基側鏈部分進行結合, 之后NPC1蛋白質與膽固醇繼續(xù)結合，把膽固醇運送到溶酶體膜上[2]，并與突觸結合蛋白VII(Syt7)合作將膽固醇轉運到下游細胞器進行利用，這一系列過程對維持神經(jīng)細胞的功能具有重要作用。研究[3-6]顯示，NPC基因缺陷可導致膽固醇堆積在細胞溶酶體內不能正常轉運，并且神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展與神經(jīng)細胞溶酶體內NPC蛋白質的基因下調有關。

27-羥基膽固醇(27-hydroxycholesterol，27-OHC)是外周膽固醇的氧化產物之一，可以自由通過血-腦脊液屏障，也是腦中最豐富的氧化固醇[7]。許多研究[8-9]顯示，阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)患者血清及腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中的27-OHC濃度升高與AD患者腦內神經(jīng)細胞的萎縮程度以及活性的喪失有關[10-11]，這些研究表明27-OHC在神經(jīng)細胞變性中起著關鍵作用。本課題組前期動物及細胞研究[12-13]顯示，27-OHC可引起SD大鼠神經(jīng)細胞溶酶體功能異常，且27-OHC對細胞產生毒性作用，并對腦內神經(jīng)細胞發(fā)育及星形膠質細胞膽固醇合成與轉運產生影響；提示27-OHC可能通過干擾溶酶體結構和功能引起腦內神經(jīng)細胞發(fā)育及星形膠質細胞膽固醇轉運的異常，但是27-OHC在神經(jīng)細胞溶酶體中的作用及具體機制尚不明確。

本研究通過神經(jīng)細胞-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系模擬神經(jīng)系統(tǒng)自然狀態(tài)，研究27-OHC對神經(jīng)細胞以及星形膠質細胞膽固醇濃度及溶酶體NPC基因表達的影響，為深入研究氧化固醇對退行性神經(jīng)疾病中的細胞機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

選用SH-SY5Y細胞系(人神經(jīng)母細胞瘤細胞)和C6細胞系(大鼠星形膠質瘤細胞)作為研究對象，分別購自北京協(xié)和細胞資源中心(CRC/PUMC)和中國科學院上海細胞庫。將細胞生長于含10%(體積分數(shù))胎牛血清和10 U/L 青鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、5.0%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)、酶標儀(Tecan公司，瑞士)、反轉錄儀(Bio-Rad公司，美國)、Real-Time PCR分析儀(Bio-Rad公司，美國)、分子成像系統(tǒng)(Vilber公司，法國)。

試劑：27-羥基膽固醇購于美國Santa Cruz公司；二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司;細胞總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Real-time PCR引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-Niemann Pick C1和Anti-Niemann Pick C2抗體購于美國Abcam公司；Anti-Niemann Pick C1和Anti-Niemann Pick C2 引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要試劑配制：27-羥基膽固醇10 mg完全溶于適量乙醇，配置成1 000 μmol/L儲備液分裝在1.5 mL離心管中，每管1 mL儲備液用氮吹儀吹干，于-80 ℃保存。臨用時，每離心管中加入200 μL DMSO用于溶解27-OHC，并加入800 μL DMEM配制成1 000 μmol/L的儲備液，之后配成工作液(5、10、20 μmol/L)。

1.2 方法

1.2.1 建立細胞共培養(yǎng)體系

模擬神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境，SH-SY5Y細胞和C6細胞在Trans-well系統(tǒng)中共培養(yǎng)。SH-SY5Y細胞(1.0×106/mL)接種于6孔板上，C6細胞(1.0×106/mL)接種于上室的聚碳酸酯膜上(孔徑0.4 μm，直徑30 mm)。上下兩室分別加入DMEM完全培養(yǎng)基進行單獨培養(yǎng)，4 h后將插入式培養(yǎng)皿接種于6孔板中，對照組加無血清DMEM，處理組進行27-OHC+無血清DMEM干預。

1.2.2 細胞分組與處理

接種細胞濃度為1.0×106/mL，當細胞生長密度達到80%～90%時，對細胞進行分組處理：對照組、27-OHC(低、中、高劑量)處理組(分別采用5、10和20 μmol/L 27-OHC處理)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細胞，待測。

1.2.3 細胞內總膽固醇濃度檢測

細胞接種密度1.0×106/mL，按照試劑盒說明書收集各組細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗細胞1次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細胞沉淀，細胞沉淀內加入100 μL裂解液裂解40 min。之后按照總膽固醇定量試劑盒說明書提供的操作流程檢測細胞內的總膽固醇濃度，進行3次獨立實驗。

1.2.4 Real-time PCR檢測

收集細胞進行RNA提取以及反轉錄之后，使用Real-time PCR儀檢測NPC1和NPC2的mRNA表達水平。Real-time PCR系統(tǒng)包含8.2 μL 無核水，10 μL MasterMix(SYBR)，1 μL cDNA和0.8 μL 引物，達到每個反應體系的總量為20 μL。進行3次獨立實驗。PCR引物，詳見表1。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primers used for Real-time PCR

1.2.5 Western blotting檢測

細胞經(jīng)過24h不同劑量27-OHC處理后，使用預冷的PBS洗滌細胞，并將0.1 mL細胞裂解緩沖液加入Trans-well小室以及六孔板中對細胞進行裂解。在4 ℃ 13 000g離心15 min收集細胞提取物。BCA蛋白質測定試劑盒用于測量蛋白質濃度。將等量的蛋白質(20 μg)加入到8%或10%(質量分數(shù))SDS-丙烯酰胺凝膠上以通過電泳分離，然后轉移到PVDF膜上。用5%(質量分數(shù))脫脂牛奶封閉1 h后，加入β-Actin(1∶1 000)、NPC1(1∶10 000)、NPC2(1∶2 000) 一抗，孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入山羊抗兔的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1h后，TBST洗滌3次，發(fā)光劑顯色發(fā)光，Vilber Lourmat Fusion SL6成像分析儀檢測分析，最后通過Image J軟件分析灰度值，進行3次獨立實驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SH-SY5Y和C6細胞內膽固醇濃度

圖1結果顯示，在中劑量和高劑量27-OHC處理組中，SH-SY5Y細胞內總膽固醇濃度均高于對照組(P=0.000)，且呈現(xiàn)升高趨勢。而C6細胞內總膽固醇濃度呈降低趨勢，27-OHC 10 μmol/L處理組和20 μmol/L組總膽固醇濃度均低于對照組(P<0.05)。

圖1 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細胞和C6細胞內總膽固醇濃度的變化Fig.1 Total cholesterol of cellular protein in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC

All data were presented as the means±SD.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；27-OHC：27-hydroxycholesterol.

2.2 27-OHC對神經(jīng)細胞及星形膠質細胞溶酶體膽固醇轉運相關因子mRNA水平的影響

與對照組相比，SH-SY5Y細胞內溶酶體NPC1基因表達下調，其中27-OHC 5 μmol/L處理組、10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比，C6細胞溶酶體NPC1基因表達上調，其中27-OHC 20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2A，3A)。

與對照組相比，SH-SY5Y細胞內溶酶體NPC2基因表達下調，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比，C6細胞溶酶體NPC2基因表達上調，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2B、3B)。

圖2 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細胞和C6細胞溶酶體NPC基因Real-time PCR溶解曲線Fig.2 Real-time PCR solubility curve of NPC1(A)and NPC2 (B) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHCNPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

圖3 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細胞和C6細胞溶酶體NPC1和NPC2基因表達變化Fig.3 mRNA expression of NPC1(A) and NPC2(B) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group; NPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

2.3 27-OHC對神經(jīng)細胞及星形膠質細胞溶酶體膽固醇轉運相關蛋白質表達的影響

27-OHC對SH-SY5Y和C6細胞NPC1和NPC2蛋白質表達的影響如圖4A所示，27-OHC下調了SH-SY5Y細胞NPC蛋白質表達，上調了C6細胞NPC蛋白質表達。

圖4B顯示，與對照組相比，SH-SY5Y細胞內溶酶體NPC1蛋白質表達下調，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C6細胞與對照組相比，溶酶體NPC1蛋白質表達上調，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4C結果顯示，與對照組比較，SH-SY5Y細胞內溶酶體NPC2蛋白質表達下調，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C6細胞溶酶體NPC2蛋白質與對照組相比，蛋白質表達呈上調趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細胞和C6細胞溶酶體NPC1和NPC2 蛋白質表達變化Fig.4 Protein levels of NPC1 (B) and NPC2 (C) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC

The results of Western blotting (A). All data were presented as the means±SD.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vscontrol group;NPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

3 討論

越來越多的研究[14-15]顯示，27-OHC對腦內膽固醇轉運具有調節(jié)作用，腦內膽固醇轉運障礙可能與27-OHC濃度的異常升高有關。本研究為更好的模擬神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境，選取神經(jīng)細胞(SH-SY5Y)[16]、星形膠質細胞(C6細胞)采用Trans-well小室共培養(yǎng)[17]，通過檢測神經(jīng)細胞和星形膠質細胞內的膽固醇濃度以及溶酶體轉運膽固醇的特異性蛋白質NPC1和NPC2的基因蛋白質表達情況，探討27-OHC對腦細胞溶酶體內膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響。本研究對共培養(yǎng)狀態(tài)下的SH-SY5Y和C6細胞進行5、10、20 μmol/L 27-OHC(高于典型生理濃度[13]處理，以模擬腦中膽固醇由星形膠質細胞轉運到神經(jīng)細胞的過程以及27-OHC向腦內流入的機制。

本研究結果顯示，27-OHC處理導致SH-SY5Y細胞內總膽固醇濃度特異性升高，C6細胞內總膽固醇濃度特異性降低，這說明27-OHC處理破壞了SH-SY5Y及C6細胞內的膽固醇轉運平衡。本課題組前期研究[18]顯示，27-OHC處理的SD大鼠腦膽固醇濃度升高；C6細胞作為膽固醇合成的主要細胞，27-OHC處理可以影響C6細胞膽固醇轉運，并通過增強ABCA1和ApoE的表達促進星形膠質細胞中的膽固醇外流[19]， Ali等[20]研究發(fā)現(xiàn)27-OHC是腦中膽固醇合成的生理抑制劑，這些結果均與本研究得到的結果一致，但是膽固醇轉運障礙是否與細胞溶酶體內膽固醇儲存以及轉運功能有聯(lián)系尚未進行研究。NPC1和NPC2是溶酶體內膽固醇儲存和轉運的特異性蛋白質[21]，本研究顯示，通過27-OHC處理可導致SH-SY5Y細胞溶酶體蛋白質NPC1和NPC2基因及蛋白質水平下調；在C6細胞中，27-OHC處理可導致NPC1基因及蛋白質水平上調。相關研究[22]顯示，在NPC1基因缺陷小鼠的神經(jīng)細胞中有膽固醇積累，神經(jīng)軸突發(fā)生異常腫脹，最終導致神經(jīng)細胞死亡；神經(jīng)細胞溶酶體中NPC1和NPC2基因表達缺陷會導致膽固醇在溶酶體中蓄集，從而導致神經(jīng)細胞膜修復、神經(jīng)軸突生長和突觸可塑性所需的膽固醇濃度低下[23-24]。以上表明，NPC1和NPC2蛋白質異常表達會影響膽固醇在神經(jīng)細胞內的轉運，從而造成神經(jīng)細胞損傷。本研究通過對SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞中總膽固醇濃度以及溶酶體NPC蛋白質進行研究，推測27-OHC處理可引起溶酶體膽固醇轉運障礙從而導致膽固醇蓄積。本課題組前期研究[19]顯示，27-OHC可促進C6細胞內膽固醇的轉運，本研究中C6細胞內溶酶體NPC蛋白質的表達升高會促進溶酶體中的膽固醇外流，以上研究結果有可能為星形膠質細胞中膽固醇濃度的降低提供證據(jù)。

綜上，27-OHC可通過下調神經(jīng)細胞中尼曼匹克蛋白質(NPC)的表達水平引起膽固醇轉運功能異常，使膽固醇在神經(jīng)細胞溶酶體內蓄積，最終導致神經(jīng)細胞膽固醇轉運障礙。關于27-OHC對神經(jīng)細胞和星形膠質細胞共培養(yǎng)體系中細胞溶酶體功能的影響作用機制，還有待于進一步研究。