宮鵬超 李艷蘭 孔翠翠 田 昕*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽 110001；2. 中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心試驗(yàn)室，沈陽 110001)

我國是腫瘤高發(fā)國家，胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期階段。晚期胃癌的治療方法主要以化學(xué)藥物治療為主，但是在臨床藥物治療過程中，腫瘤細(xì)胞會逐漸產(chǎn)生以抗凋亡為主要特征的耐藥性[1]，使抗腫瘤藥物失去對其的殺傷作用。然而，在近年研究[2]中顯示，當(dāng)傳統(tǒng)的凋亡途徑受到抑制時(shí)，細(xì)胞會通過程序性壞死這種后備的細(xì)胞死亡途徑引起細(xì)胞的死亡。蟾蜍靈(Bufalin)的抗癌作用在近年來成為了研究熱點(diǎn)，其分子式為C24H34O4，相對分子質(zhì)量為386.5，是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物中提取的主要成分之一。蟾蜍靈通過凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的觀點(diǎn)被大多數(shù)研究[3-4]所認(rèn)同。但是在回顧既往研究[4]成果時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生非凋亡性死亡。本研究將蟾蜍靈(Bufalin)作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞，探討蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的機(jī)制，為蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡的機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院腫瘤研究所二室提供。胎牛血清(美國Mediatech公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，蟾蜍靈、MTT、DMSO(二甲基亞砜)(美國Sigma公司)，4，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，碘化丙啶(propidium iodide,PI)(北京索萊寶科技有限公司)，ECL發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)，受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1， RIP1)抗體(英國Abcam公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，RIP1蛋白抑制劑(necrostain-1，NEC-1)。

1.2 檢測方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)在含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。對照組的SGC-7901細(xì)胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，不加任何干預(yù)因素(蟾蜍靈濃度為0)。實(shí)驗(yàn)組的SGC-7901細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌瑵舛鹊捏蛤莒`(50、100、150、200 nmol/L)。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

每孔100 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×105/mL的密度種植在96孔板中，待次日待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，對照組中加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組中加入不同濃度蟾蜍靈繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。96孔板中每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔。處理時(shí)間結(jié)束后，在每孔中加入5 g/L的MTT 20 μL，在37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2的條件下孵育4 h后吸除孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO震蕩10 min，使沉淀充分溶解。酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇蟾蜍靈濃度相同時(shí)，24、48 h兩組差異較大的濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)組的蟾蜍靈濃度值。

1.2.3 DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)

將處于對數(shù)生長期細(xì)胞按適宜密度接種于6孔板中，對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入蟾蜍靈(100 nmol/L)處理24、48 h，待處理時(shí)間結(jié)束后，吸除對照組及實(shí)驗(yàn)組孔內(nèi)液體，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，室溫下固定15 min，吸除固定液并加入少量DAPI染色液，室溫放置3～5 min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔洗滌細(xì)胞5 min，3次，直接在熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

離心收集對照組及實(shí)驗(yàn)組(100 nmol/L，24、48 h)細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛，4 ℃固定細(xì)胞沉淀6～12 h后吸出固定液，加入預(yù)冷PBS放置4 h，加入1%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸固定1 h，PBS洗滌細(xì)胞后經(jīng)過脫水、包埋、修塊、切片、染色等步驟，透射電鏡觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞壞死率

將細(xì)胞按適宜密度種植于6孔板中，次日待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，對照組更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組1加入蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)組2經(jīng)NEC-1(20 μmol/L)預(yù)處理2 h后加入蟾蜍靈(100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。處理時(shí)間結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞沉淀，1 000 r/min離心5 min，3次，加入5 μL PI，混勻細(xì)胞沉淀后流式細(xì)胞儀檢測并記錄結(jié)果。

1.2.6 Western blotting法檢測RIP1蛋白表達(dá)量

用BCA蛋白定量試劑盒確定收集的兩組細(xì)胞總蛋白濃度，確定濃度的樣品煮沸后于-80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠分離，恒流濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜或室溫孵育2 h，洗膜后二抗室溫孵育2 h，ECL法顯色。Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蟾蜍靈對細(xì)胞活性的影響

蟾蜍靈對SGC-7901細(xì)胞活性的抑制作用有明顯劑量依賴性，隨著蟾蜍靈濃度的升高細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降趨勢。蟾蜍靈在24 h和48 h的IC50分別為(111.55±7.25)nmoL/L和(90.51±2.50)nmol/L。蟾蜍靈處理細(xì)胞24、48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。藥物濃度相同情況下，48 h與24 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，除50 nmol/L濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余濃度組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 不同濃度蟾蜍靈處理 SGC-7901細(xì)胞24、48 h后對細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Bufalin on cell viability after 24 h and 48 h treatment of SGC-7901 cells

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vs24 h at the same concentration.

2.2 DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)

RPMI 1640處理對照組， 蟾蜍靈(100 nmol/L)處理對照組，處理時(shí)間結(jié)束后(24 h、48 h)，細(xì)胞核沒有出現(xiàn)明顯凋亡特征性改變，與對照組相比并無明顯變化，詳見圖2。

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)組經(jīng)蟾蜍靈(100 nmol/L)處理24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜連續(xù)性出現(xiàn)破壞，并伴有大量細(xì)胞內(nèi)空泡的產(chǎn)生，細(xì)胞核無明顯改變。蟾蜍靈(100 nmol/L)處理細(xì)胞48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜完全崩解，細(xì)胞核未見明顯改變，詳見圖3。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞壞死率

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)處理細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的逐漸升高，細(xì)胞壞死率由對照組的4.52%±0.84% 增高至實(shí)驗(yàn)組的8.88%±1.32%、20.26%±2.70%、41.5%±1.77% 和48.95%±2.92%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)(圖4)。細(xì)胞經(jīng)RIP1蛋白抑制劑NEC-1預(yù)處理2 h后，再用蟾蜍靈(100 nmol/L)處理細(xì)胞48 h，細(xì)胞壞死率由未經(jīng)NEC-1預(yù)處理時(shí)的24.36%±2.14% 降低至16.21%±4.28%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖2 蟾蜍靈處理SGC-7901細(xì)胞24、48 h后對細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.2 Effect of Bufalin on the morphology of nuclear changes after 24 and 48 h treatment of SGC-7901 cells

圖3 蟾蜍靈處理SGC-7901細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(10 000×)Fig.3 Morphological changes of cells treated with Bufalin after 24 and 48 h in SGC-7901 cells

圖4 不同濃度蟾蜍靈處理SGC-7901細(xì)胞48 h后對細(xì)胞壞死率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of bufalin on the necrosis rate of SGC-7901 cells after 48 h

2.5 Western blotting法檢測RIP1蛋白的表達(dá)

用不同濃度蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)處理SGC-7901細(xì)胞48 h后，與對照組相比，蟾蜍靈濃度分別為100、150、200 nmol/L的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RIP1蛋白的表達(dá)明顯增加。50 nmol/L濃度組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余濃度組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖5 RIP1蛋白抑制劑NEC-1處理后對細(xì)胞壞死率的影響Fig.5 Effect of RIP1 protein inhibitor NEC-1 on cell necrosis

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsBufalin at the same concentration and time；NEC-1:necrostain-1.

3 討論

胃癌在全世界及我國范圍內(nèi)均位于惡性腫瘤死亡前列。在臨床治療過程中，晚期胃癌患者占較大比重，而晚期胃癌的治療手段主要以化學(xué)藥物治療為主。雖然現(xiàn)階段的臨床藥物治療針對的靶點(diǎn)與治療機(jī)制并不相同，但都是以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡為主，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[5-6]。但是，在實(shí)際臨床治療過程中，腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生凋亡抵抗的問題，是臨床治療過程中一個(gè)難以克服的障礙[7]。

圖6 不同濃度蟾蜍靈處理SGC-7901細(xì)胞48 h后對RIP-1表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of Bufalin on the expression of RIP-1 in SGC-7901 cells after 48 h treatment

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

在2005年Degterev等[8]首次提出了壞死性凋亡(necroptosis)這一概念。程序性壞死發(fā)生時(shí)的形態(tài)學(xué)改變是以壞死樣的改變?yōu)橹饕卣?，?xì)胞膜完整性的破壞和細(xì)胞器的腫脹發(fā)生于程序性壞死的早期，并且在局部會伴有嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[9-10]，同時(shí)，又受到特定的細(xì)胞信號通路調(diào)控，是一種不依賴于凋亡信號通路中Caspase信號分子調(diào)控的有序的細(xì)胞死亡過程。程序性壞死途徑可由各種因素所激活，而由腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)這種傳統(tǒng)的多效性的細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的“死亡受體-RIP1/RIP3-MLKL-PGAM5”程序性壞死途徑研究的最為深入[11-13]。在該信號通路中，能夠傳遞死亡信號的必要條件，就是形成RIP1、RIP3和MLKL所組成的壞死復(fù)合物(necrosome)[14-15]，而形成復(fù)合物的重要啟動分子就是RIP1。隨著RIP1的活化，RIP3、MLKL及PGAM5等下游分子相繼活化。因此，本研究通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測壞死率、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和Western blotting法檢測等一系列方法，探討蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞程序性壞死的可能機(jī)制。

MTT法檢測細(xì)胞活性常用于研究藥物對細(xì)胞增生的影響[16]。本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蟾蜍靈對SGC-7901細(xì)胞生長的抑制作用呈時(shí)間和劑量的依賴性。DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)是否發(fā)生改變，可以初步判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)蟾蜍靈處理后并不會發(fā)生典型的凋亡性改變，說明蟾蜍靈誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞死亡還可能通過其他途徑。細(xì)胞發(fā)生程序性壞死時(shí)在形態(tài)學(xué)上的改變主要以細(xì)胞壞死的特點(diǎn)為主。透射電鏡是觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的金標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞膜與胞質(zhì)的變化最為明顯，表明細(xì)胞死亡的方式并不是凋亡，而是壞死。隨后，筆者通過PI染色后流式細(xì)胞儀檢測這種檢測細(xì)胞壞死的常用手段發(fā)現(xiàn)，隨著蟾蜍靈的濃度升高，細(xì)胞的壞死率隨之升高，呈明顯的劑量依賴性。RIP1特異性抑制劑NEC-1可以使細(xì)胞壞死率降低，進(jìn)一步證明了蟾蜍靈可以使SGC-7901細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。Western blotting法檢測結(jié)果表明，隨著蟾蜍靈濃度的增加，程序性壞死關(guān)鍵分子RIP1的表達(dá)量隨著蟾蜍靈濃度的升高而逐漸升高。

綜上所述，本研究以胃癌SGC-7901細(xì)胞作為模型，來評估蟾蜍靈誘導(dǎo)的程序性壞死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明蟾蜍靈可以通過RIP1介導(dǎo)的程序性壞死途徑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞死亡。本研究為蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡的機(jī)制提供新的理論依據(jù)。