權(quán)竹聲 張曉麗 朱進霞

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100069)

腸膠質(zhì)細胞(enteric glial cell，EGC)是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。EGC主要分布于腸壁黏膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢，其中黏膜下神經(jīng)叢EGC可以調(diào)節(jié)腸上皮細胞的增生、凋亡及遷移，維護腸黏膜屏障[1-2]，而肌間神經(jīng)叢EGC則在胃腸道動力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[3-4]。近年來研究顯示糖尿病、帕金森病和慢性傳輸型便秘患者結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中的EGC數(shù)量、形態(tài)和分布明顯異常[5-7]，而 EGC的異常激活可能是誘導腸易激綜合征(irritable bowel syndrome， IBS)結(jié)腸動力紊亂的重要因素[8]，表明結(jié)腸肌間神經(jīng)叢EGC可能參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機制目前仍不清楚。原代EGC培養(yǎng)可排除在體環(huán)境下的神經(jīng)體液因素，是深入探討EGC功能特性的重要方法。目前已有腸道肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)方法的報道[9-11]，但關(guān)于培養(yǎng)過程中成纖維細胞污染的去除，現(xiàn)有方法尚需改進。有研究者嘗試應用無血清法去除雪旺細胞培養(yǎng)中成纖維細胞的污染，效果良好[12-13]，但此方法尚未運用于EGC的原代培養(yǎng)。本實驗方法結(jié)合無血清培養(yǎng)改進現(xiàn)有的肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)法，有效去除了成纖維細胞污染，獲得了純度較高，活性良好的結(jié)腸肌間神經(jīng)叢EGC，現(xiàn)將具體方法闡述如下，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年雄性C57/BL6 品系小鼠(由首都醫(yī)科大學實驗動物部提供)，體質(zhì)量20～22 g，許可證號：SCXK(京)2012-0001，嚴格按照實驗動物福利委員會許可操作，動物在22 ℃±1 ℃溫度條件下飼養(yǎng)，給予正常晝夜更替12 h/12 h光照及24 h食物與水分供應。

1.2 小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢EGC的原代培養(yǎng)

器械經(jīng)仔細清洗，75%(體積分數(shù))乙醇浸泡30 min后烘干置于室溫備用。小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，75%(體積分數(shù))乙醇棉球消毒腹部皮膚，沿腹正中線剪開腹腔，迅速取出結(jié)腸組織置于通有混合氣[95%(體積分數(shù))O2, 5%(體積分數(shù)) CO2]的4 ℃ Krebs液中。沖洗腸腔去除內(nèi)容物，將結(jié)腸組織剪成約1 cm長的腸段，置于另一盛有無菌Krebs液的燒杯中重復沖洗2～3次。取一段腸管套在玻璃棒上，去除腸系膜，以精細鑷沿腸系膜附著處的腸管縱軸自上而下輕輕劃出一縱行肌缺口，用Krebs液濕潤的棉簽小心剝離縱行肌(肌間神經(jīng)叢一般附著于縱行肌)，置于無菌、通氣的4 ℃ Krebs液中，重復以上操作處理其余腸段。收集縱行肌組織于Krebs液中，4 ℃，356g離心30 s，棄上清，將組織移至另一無菌離心管重復以上操作3次以清洗組織。稱?、蛐湍z原酶13 mg，牛血清白蛋白3 mg溶于10 mL無菌 Krebs液配成消化液備用。組織置于消化液中，剪碎，37 ℃消化60 min，期間通氣并震蕩。4 ℃，356g離心8 min，入無菌操作間，棄上清，加入5 mL 0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶，37 ℃消化7 min，等體積培養(yǎng)基(DMEM/F12)終止消化。離心，棄上清，1 mL培養(yǎng)基重懸，尼龍網(wǎng)過濾，離心，棄上清，完全培養(yǎng)基[含10%(體積分數(shù))胎牛血清，1%(質(zhì)量分數(shù))雙抗的DMEM/F12]重懸，接種于24孔板中，置于37 ℃，5%(體積分數(shù)) CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后鏡下觀察可見EGC已貼壁，此外還可見呈桿狀、懸浮的肌細胞及未消化完全的組織碎屑等，以PBS清洗3次去除懸浮細胞后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。若有少量肌細胞貼壁，可用0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶消化3 min,即可去除肌細胞而對EGC無影響。之后每2天換液，一周后更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d，待成纖維細胞脫落殆盡時更換完全培養(yǎng)基，可根據(jù)成纖維細胞污染情況重復以上操作，至細胞80%融合后傳代。待傳至第四代時神經(jīng)元細胞已死亡，可得到純度較高的腸膠質(zhì)細胞。每次實驗取4只小鼠結(jié)腸縱行肌-肌間神經(jīng)叢組織，至傳代前細胞量可達約6.8×105。

1.3 細胞免疫熒光染色

將細胞懸液接種至預先放有蓋玻片的24孔板中，約24 h細胞貼壁良好后進行染色。細胞爬片經(jīng)PBS洗滌3次×3 min，4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗滌3次×3 min，滴加5%(體積分數(shù))驢血清，室溫封閉30 min，完成后棄去封閉血清，加入一抗GFAP(04-1031，美國Millipore公司)、S100β(sc-393919，美國Santa Cruz Biotechnology公司)進行雙標記，4 ℃過夜孵育。次日取出，棄去一抗(A11055，美國Invitrogen公司)，PBS 洗滌3次×10 min，滴加二抗(A21203, 美國Invitrogen公司)，避光室溫孵育2 h后滴加DAPI，5 min后PBS 洗滌3次，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝。共取來自3批細胞的6個隨機鏡下視野，分別統(tǒng)計GFAP和S100β單陽性或雙陽性細胞數(shù)在細胞總數(shù)中的比例。

1.4 探針負載細胞觀察胞內(nèi)[Ca2+]i變化

細胞傳代24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，以5 μmol/L熒光探針fluo-4 AM(S1060，碧云天生物技術(shù)公司)負載細胞，避光37 ℃孵育40 min后棄去熒光探針，PBS清洗3次，加入HBSS液，在激光共聚焦顯微鏡(UltraVIEW Vox，美國PerkinElmer公司)下觀察。選擇貼壁良好、形態(tài)伸展、熒光強度較亮的細胞，設置掃描條件為488 nm波長激發(fā)、 39%激光強度、 PMT(790)、 Pinhole(310 μm)、每2 s采集一幅。首先掃描2 min待熒光強度穩(wěn)定后加藥(ATP 10 μmol/L)，待熒光強度穩(wěn)定后終止實驗。共取3批細胞進行6次實驗，每次實驗對視野中細胞進行實時熒光強度數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計ATP給藥后發(fā)生胞內(nèi)鈣瞬變的細胞比例及每個反應細胞最大熒光強度與基礎熒光強度的比值(Fm/F0)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 EGC在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是目前較常用的成熟EGC標志物，小鼠結(jié)腸組織水平免疫熒光雙標記結(jié)果顯示，GFAP陽性的EGC在肌間神經(jīng)叢大量分布，并與神經(jīng)元標志物神經(jīng)原纖維(neurofilament，NF)不共存，表明GFAP可作為結(jié)腸EGC的標志物，詳見圖1。

2.2 原代EGC純度

運用EGC標志物GFAP免疫熒光標記EGC，觀察其在原代細胞中的比例，結(jié)果顯示運用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代細胞中，只有部分細胞表現(xiàn)出GFAP陽性，以平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)與GFAP雙標記染色可見，GFAP陰性的細胞多表現(xiàn)為α-SMA陽性，且胞核呈卵圓形，符合成纖維細胞的特征(圖2A)，表明含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代細胞中存在大量的成纖維細胞污染。運用無血清培養(yǎng)后，可見原代細胞中絕大多數(shù)細胞均呈現(xiàn)GFAP陽性(圖2B)，以另一種常用的EGC標志物S100β與GFAP雙標記并統(tǒng)計免疫陽性細胞在原代細胞中的百分比可得，GFAP陽性EGC占細胞總數(shù)的98.44%±1.07 %，95%CI為(95.70，101.2)；S100β陽性EGC占93.61%±3.16%，95%CI為(85.48，101.7)；GFAP與S100β雙陽性EGC占比93.09%±2.99%，95%CI為(85.4,100.8)，結(jié)果來自6個鏡下視野共100個細胞，表明無血清培養(yǎng)成功去除了成纖維細胞污染且得到的EGC純度較高。

圖1 EGC在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布Fig.1 Distribution of EGC in colonic myenteric plexus

A： double-label immunofluorescence of GFAP and NF in myenteric plexus of colon；NF：neurofilament；GFAP：glial fibrillary acidic protein；EGC：enteric glial cell.

圖2 原代EGC 細胞純度Fig.2 Purity of primary EGC

A：double-label immunofluorescence of GFAP and α-SMA in serum-containing cultured EGC;B：double-label immunofluorescence of GFAP and S100-β in serum-free cultured EGC；EGC：enteric glial cell;GFAP：glial fibrillary acidic protein;α-SMA:α-smooth muscle actin.

2.3 原代EGC活性檢測

EGC在接受ATP刺激后可表現(xiàn)出顯著的胞內(nèi)鈣瞬變，而成纖維細胞則不具備這種特性。以Ca2+熒光探針fluo-4 AM孵育細胞，給予10 μmol/L ATP，利用熒光顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)檢測探針熒光強度，動態(tài)觀察細胞內(nèi)[Ca2+]i的變化。如圖3所示，靜息狀態(tài)下胞內(nèi)[Ca2+]i維持在較平穩(wěn)的水平，ATP給藥后，96.00%±4.00 %，95%CI為(84.89,107.1)的細胞發(fā)生胞內(nèi)鈣瞬變，結(jié)果來自3批細胞共6次實驗，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)[Ca2+]i在短時間內(nèi)快速升高(Fm/F0=1.93±0.08)隨后又迅速恢復至基線水平的周期性變化，提示原代EGC反應性良好。

圖3 ATP引起原代EGC胞內(nèi)鈣瞬變Fig.3 ATP induced Ca2+ transients in primary EGC

A： representative images of primary EGC loaded with Fluo-4 at rest (left) and upon activation (right) with ATP (10 μmol/L)；scalebar:70 μm;B： representative traces of ATP-induced Ca2+transients for three individual cells；EGC：enteric glial cell.

3 討論

肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)過程中，成纖維細胞在操作中難以去除，在細胞培養(yǎng)過程中分裂增生十分迅速，因此成為制約EGC原代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。本實驗室利用成纖維細胞對血清依賴生長的特性，在現(xiàn)有肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)方法[9]中結(jié)合無血清法，較特異地去除了成纖維細胞污染。

本實驗前期，本課題組參考了Smith等[9]建立的小鼠原代EGC分離方法，成功分離了小鼠結(jié)腸EGC，但在細胞鑒定中觀察到大量GFAP陰性而α-SMA陽性的細胞，提示原代細胞中存在成纖維細胞污染。在運用無血清法培養(yǎng)后，可見GFAP陰性細胞顯著減少，表明無血清培養(yǎng)法可有效去除成纖維細胞污染。Smith等[9]的文章中并未統(tǒng)計原代細胞純度，本實驗中，統(tǒng)計GFAP陽性細胞占比超過98%，95%CI為(95.70,101.2)，表明純度較高，符合實驗要求。

多項研究表明ATP可以激發(fā)EGC胞內(nèi)Ca2+濃度的顯著變化，如Gulbransen等[14]運用了組織原位Ca2+顯像技術(shù)，觀察到ATP可引起豚鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中95.5% 的EGC發(fā)生鈣瞬變，而Boesmans等[15]的研究顯示，ATP可激發(fā)人十二指腸黏膜下神經(jīng)叢原代EGC胞內(nèi)鈣瞬變，反應細胞比例約為53%。本實驗中可以檢測到約96%，95%CI為(84.89,107.1)的無血清培養(yǎng)原代EGC在ATP作用下發(fā)生胞內(nèi)鈣瞬變，這與Gulbransen等[14]的組織原位檢測結(jié)果相近，提示原代EGC反應性良好。而Boesmans等[15]的研究中反應細胞比例較低，原因可能在于人與嚙齒類動物的種屬差異，也可能在于原代細胞反應性差異。

針對原代EGC去除成纖維細胞的方法已有多方面嘗試，如抗有絲分裂法、差速貼壁法、流式細胞法、磁珠分選法等。其中抗有絲分裂法的原理是成纖維細胞分裂增生速率高于EGC，加入抗有絲分裂劑可顯著抑制成纖維細胞增生，但此法也存在弊端。由于EGC有一定的增生速率，會受到抗有絲分裂劑的影響，培養(yǎng)中若不能找到適宜的用藥劑量，將會嚴重影響EGC的增生。而成纖維細胞對血清的依賴遠高于EGC，無血清法對EGC生長的影響則相對較小。差速貼壁法利用成纖維細胞貼壁更快的特性，在反復貼壁操作中去除成纖維細胞，但由于EGC亦屬易貼壁細胞，操作中若不能把握合適的時間點，極易丟失目的細胞，相比之下無血清法能更大限度的減少EGC的丟失。流式細胞法和磁珠分選法利用免疫篩選原理分選細胞，精確度更高，但成本亦相對較高，且目前國內(nèi)的流式細胞儀難以提供嚴格的無菌條件，細胞污染的概率亦較高，相比之下無血清法操作簡便、成本低廉且不會造成細胞污染。本實驗為原代EGC分離純化提供了新的參考，為EGC功能的探究提供了良好的技術(shù)基礎。