王 佳 樂(lè) 凱 郭懿樊 郭 旭 張 濤 任 宇 王睿斌 許光中鄭海亮 馮樹(shù)理 朱 斌*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院普通外科及腫瘤外科， 北京 100038；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程處， 北京 100038)

胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速且預(yù)后極差的惡性腫瘤[1]。數(shù)據(jù)[1-3]顯示其發(fā)病率及病死率逐年上升，已嚴(yán)重危害人類健康。早期診斷是提高胰腺癌預(yù)后的首要措施，但目前仍缺乏早期診斷的手段[4-6]。同步輻射X線相襯成像技術(shù)對(duì)軟組織具有非常高的襯度分辨率，可以顯示數(shù)十微米的血管，區(qū)分腫瘤組織和正常組織，使用的X線劑量遠(yuǎn)低于電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography， CT)，大幅度降低了輻射的危害，因此具有巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠胰腺原位移植瘤模型，結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，探討同步輻射X射線相襯成像技術(shù)對(duì)胰腺癌早期診斷的價(jià)值，擬為胰腺癌早期診斷提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

nu/nu雌性裸鼠，16～24 g，4～6周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(京)2013-003；人胰腺癌PANC-1細(xì)胞系由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部惠贈(zèng)；多源MRI系統(tǒng)(Achieva 3.0 T TX, 荷蘭Philips公司)；北京同步輻射裝置4W1A光束線和形貌站等。

1.2 方法

1.2.1 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)條件：CO2濃度5%(體積分?jǐn)?shù))，溫度37 ℃，濕度95%；培養(yǎng)基為含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)并傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁70%～80%后制備PANC-1單細(xì)胞懸浮液108/mL×1 mL，備用。

1.2.2 動(dòng)物分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理因素不同，將32只nu/nu雌性裸鼠應(yīng)用數(shù)字表法隨機(jī)分為A組(n=24)和B組(n=8)；再根據(jù)術(shù)后1、2、3、4周處理時(shí)間的不同，將兩組裸鼠隨機(jī)分別分為4個(gè)亞組：A1、A2、A3、A4(n=6)和B1、B2、B3、B4(n=2)。

1.2.3 動(dòng)物模型建立

手術(shù)前12 h禁食但不禁水，稱裸鼠體質(zhì)量，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后仰臥位固定，碘伏消毒。左上腹正中偏左約0.5 cm處(透過(guò)裸鼠腹部皮膚看見(jiàn)脾臟處)開(kāi)腹、充分暴露胰腺，顯微鏡下操作。A組：胰腺被膜下接種單細(xì)胞懸浮液108/mL×20 μL，避免PANC-1細(xì)胞懸浮液散落于腹腔，復(fù)位器官、關(guān)腹。B組：胰腺被膜下注射20 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，其他操作同A組，詳見(jiàn)圖1。術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)鼠的精神狀態(tài)、飲食及活動(dòng)狀況。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)倫理?xiàng)l例。

圖1 模型建立過(guò)程Fig. 1 Established modelA：marked; B： exposed pancreas; C： injected cells; D： completed.

1.2.4 MRI掃描

掃描前12 h禁食不禁水，稱量裸鼠體質(zhì)量，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉完全后將裸鼠置于小動(dòng)物線圈內(nèi)。術(shù)后1、2、3、4周，每只裸鼠行MRI橫斷面、冠狀面和矢狀面掃描，平掃完成后，不移動(dòng)裸鼠位置，經(jīng)腹腔注入馬根維顯注射液(0.1 mmol/kg)，待馬根維顯注射液在體內(nèi)分布均勻后行增強(qiáng)掃描。掃描參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 MRI掃描參數(shù)Tab. 1 Scaning parameters of MRI

MRI:magnetic resonance imaging;FSE:fast spin echo.

1.2.5 標(biāo)本采集、同步輻射X線相襯成像

MRI掃描后，頸椎脫臼處死裸鼠，解剖暴露裸鼠腹腔，肉眼觀察腹腔內(nèi)情況，采集胰腺標(biāo)本并固定在10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛24 h，吸干標(biāo)本表面液體后行類同軸成像和衍射增強(qiáng)成像。衍射增強(qiáng)參數(shù)詳見(jiàn)表2，儀器設(shè)備參數(shù)詳見(jiàn)表3。

1.2.6 病理檢查

石蠟塊切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, staining, HE)染色。以上結(jié)果均由一名對(duì)應(yīng)的專業(yè)人員在不知分組情況下進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況

A組裸鼠存活22只，死亡2只，A1組因麻醉意外死亡1只，A4組因脾損傷出血死亡1只，死亡鼠均已剔除實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。B組裸鼠無(wú)死亡。

表2 衍射增強(qiáng)參數(shù)Tab. 2 Parameters of diffraction enhancement

表3 實(shí)驗(yàn)站設(shè)備參數(shù)Tab.3 Parameters of equipment

2.2 成瘤率

2.3 MRI表現(xiàn)

裸鼠腹腔內(nèi)臟器顯示清晰，其中A1組、A2組胰腺內(nèi)未發(fā)現(xiàn)腫物；A3組胰腺內(nèi)可見(jiàn)直徑約0.8 cm的信號(hào)不均勻腫物，強(qiáng)化后邊緣強(qiáng)化稍明顯；A4組胰腺內(nèi)可見(jiàn)直徑約1.0 cm的信號(hào)不均勻腫物，強(qiáng)化后邊緣強(qiáng)化稍明顯。分析結(jié)果顯示，在A1組和A2組，MRI的靈敏度均為0，表明MRI沒(méi)有早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的作用，詳見(jiàn)表4、圖2。B組裸鼠顯示胰腺形態(tài)正常，胰腺及腹腔內(nèi)未見(jiàn)腫物。

2.4 同步輻射X線相襯成像

衍射增強(qiáng)及類同軸成像：圖像數(shù)據(jù)經(jīng)重建后胰腺結(jié)構(gòu)顯示清晰，A1組未見(jiàn)胰腺腫物形成；A2組部分胰腺組織內(nèi)可見(jiàn)直徑分別2.0、0.5 mm的腫物，邊緣欠光滑，毛刺樣改變。分析結(jié)果顯示，同步輻射X線相襯成像在A1組的靈敏度為0，但在A2組的靈敏度和特異度均達(dá)到了100%，靈敏度明顯高于MRI掃描(P=0.029)，表明同步輻射X線相襯成像有早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的作用，詳見(jiàn)表4、圖2。B組胰腺內(nèi)未見(jiàn)腫物形成。

表4 胰腺癌診斷檢測(cè)方法Tab.4 Methods for pancreatic cancer diagnosis

圖2 MRI增強(qiáng)掃描和同步輻射X線相稱成像Fig.2 MRI and synchrotron radiation X-ray imaging

A： MRI plain axial image of A1, no mass formation;B,C,D： MRI enhanced scan axial/coronal/sagittal image of A3, respectively, a mass about 8.0 mm×8.0 mm×6.0 mm in pancreas was observed, which signal was uneven;E,F： X-ray phase-contrast imaging and diffraction-enhanced imaging of A2, two tumors with diameter approximately 2.0 mm and 0.5 mm were observed in pancreas, which edges were not smooth and burr-like;G,H： reconstructed images of C, D； Red arrows represented pancreatic tumor in MRI, yellow arrows represented pancreatic tumor in synchrotron radiation X-ray imaging.MRI:magnetic resonance imaging.

2.5 大體形態(tài)

A1組胰腺形態(tài)正常，色灰紅，質(zhì)稍韌，肉眼未見(jiàn)腫物；A2組部分胰腺內(nèi)腫物形成，最大者約0.2 cm×0.3 cm×0.15 cm，質(zhì)韌，腫物切面灰白色，血管不明顯；A3組腫物最大者約1.0 cm×1.1 cm×0.8 cm，質(zhì)韌，切面灰白，血管較豐富；A4組腫物最大者2.2 cm×1.9 cm×1.2 cm，質(zhì)韌，切面灰白，血管豐富，部分腫物內(nèi)見(jiàn)壞死。詳見(jiàn)圖3所示。B組裸鼠胰腺組織形態(tài)正常，色灰紅，無(wú)腫物形成。

2.6 病理組織學(xué)改變

A組成瘤裸鼠胰腺病理檢查為低分化腺癌，腫瘤彌漫片狀浸潤(rùn)周圍胰腺，瘤組織呈片狀分布，胞質(zhì)紅染，核異型顯著，核分裂易見(jiàn)，可見(jiàn)病理性核分裂、散在凋亡細(xì)胞、灶狀退變，血管內(nèi)見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。A1組中部分胰腺內(nèi)見(jiàn)胰腺癌形成，直徑約0.45～0.8 mm，未見(jiàn)腫瘤壞死，詳見(jiàn)圖4。B組：部分呈現(xiàn)為慢性胰腺炎特征。

圖3 A4組裸鼠標(biāo)本Fig.3 Specimen of A4 mouse

A：A part knurl could be seen before the pancreas specimen and the shape was irregular;B： A tumor was observed in pancreas after laparotomy, which has unclear border with pancreatic tissue and no abnormalities in other organs;C：tumorinvivo;D：tumor was isolated. The tumor size was about 2.2 cm×1.9 cm×1.2 cm.

圖4 A組裸鼠胰腺病理圖片HE染色Fig.4 Histopathological pictures of pancreas of group A mouse (HE staining)

A： pathological photo of A2, low grade adenocarcinoma was confirmed by pathology (100×, same as the specimen in synchrotron radiation X-ray imaging);B： Cancer cells infiltrated blood vessel (red arrows, 40×).

3 討論

目前胰腺癌動(dòng)物模型主要分為3種[9]：移植瘤模型、致癌物誘導(dǎo)模型和基因工程模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種PANC-1細(xì)胞系至裸鼠胰腺的原位移植瘤方法建立胰腺癌模型，和基因工程模型相比，造模方法更簡(jiǎn)單。和化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型約43%的成瘤率比較[10]，本研究中的原位移植模型成瘤率高，平均成瘤率達(dá)73%；隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，成瘤率逐漸升高，建模4周后成瘤率達(dá)100%，明顯高于建模1周后的成瘤率，該結(jié)果與胡偉澤等[11]及何偉等[12]的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)建模采用人胰腺癌PANC-1細(xì)胞系，高度符合人胰腺癌的特征。原位移植瘤模型保留了腫瘤組織原本的組織形態(tài)、免疫學(xué)等優(yōu)點(diǎn)，但操作時(shí)，應(yīng)仔細(xì)、謹(jǐn)慎，避免腫瘤細(xì)胞掉落腹腔，造成腫瘤移植于腹腔內(nèi)其他部位；也應(yīng)避免及減少其他損傷，本實(shí)驗(yàn)就有1只裸鼠建模時(shí)因損傷脾臟出血致死。

X線穿過(guò)物體之后記錄該物體的相位變化，組織內(nèi)很細(xì)微的解剖結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生良好的圖像，相襯成像技術(shù)就是一種利用X線透過(guò)樣品后攜帶的相位改變的信息對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰成像的技術(shù)。因此，近年來(lái)該技術(shù)被醫(yī)療界用于對(duì)細(xì)微組織的研究[13]。同步輻射X線相襯成像技術(shù)是將同步輻射X線與相襯成像結(jié)合在一起，其空間分辨率可達(dá)0.35 μm，密度分辨率達(dá)0.002～0.000 3 g/cm3，意味著同步輻射X線相襯成像不僅可以觀察腫瘤內(nèi)部血管、纖維結(jié)構(gòu)等，還能區(qū)分腫瘤組織和正常組織[14-15]。利用同步輻射X線成像技術(shù)研究腫瘤動(dòng)物模型的早期腫瘤發(fā)病過(guò)程，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)學(xué)科的發(fā)展可能具有重大的科學(xué)價(jià)值。

目前，同步輻射X線相襯成像對(duì)胃癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的研究[16]已有報(bào)道，但尚無(wú)胰腺癌研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用同步輻射X線相襯成像技術(shù)對(duì)胰腺原位移植瘤進(jìn)行研究，結(jié)果顯示同步相襯成像可以清楚顯示0.5 mm的胰腺癌，與MRI檢查相比，體現(xiàn)出其高空間分辨率和密度分辨率的優(yōu)點(diǎn)。在本課題組的前期工作中，利用衍射增強(qiáng)成像和類同軸成像方法，也能發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤的血管蒂，有助于腫瘤的診斷。

傳統(tǒng)CT成像時(shí)所用X線能量120～140 keV，通過(guò)表3中參數(shù)可知，本實(shí)驗(yàn)中使用的光源能量為12 keV，在成像效果更好的前提下大大降低了X線的輻射劑量，從而降低了輻射可能對(duì)機(jī)體的損傷。

目前，由于設(shè)備的限制，不能夠進(jìn)行大標(biāo)本的成像，因此本實(shí)驗(yàn)只分析裸鼠離體的胰腺標(biāo)本，取得了較為滿意的結(jié)果。下一步，希望利用同步輻射相襯成像設(shè)備對(duì)活體裸鼠進(jìn)行成像，進(jìn)一步探討同步輻射X線相襯成像在胰腺癌早期診斷中的價(jià)值。