張媛媛 葛 洋 安廣宇

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科，北京 100020 )

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)胰腺癌的致死率居于腫瘤相關(guān)死因的第4位，且胰腺癌患者的5年生存率僅為5%[1]。已有研究[2-3]報(bào)道，胰腺癌中存在一種具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，此細(xì)胞亞群對標(biāo)準(zhǔn)放射治療及化學(xué)藥物治療方法易產(chǎn)生耐受，從而導(dǎo)致胰腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，探尋新型有效的胰腺癌治療策略以改善胰腺癌患者的預(yù)后及生存能力成為目前的研究熱點(diǎn)。雙腎上腺素樣激酶1 (doublecortin-like kinase 1，DCLK1) 是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶家族的微管結(jié)合成員，是公認(rèn)的腸和胰腺腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)志物[4]。Bailey等[5]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌的侵襲和浸潤依賴于DCLK1陽性腫瘤細(xì)胞，此類細(xì)胞具有類似腫瘤干細(xì)胞的特性。人類DCLK1編碼基因位于染色體13q13.3區(qū)域，含有5′端和3′端兩個(gè)不同的啟動(dòng)子序列，其中5′α 啟動(dòng)子編碼DCLK1全長(約82 000，DCLK1-L, 亞型1/2，DCLK1長型)，3′β 啟動(dòng)子僅編碼DCLK1的C末端激酶區(qū)域(約45 000～50 000，DCLK1-S, 亞型3/4, DCLK1短型)，形成具有不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的剪接異構(gòu)體[6]。近年的研究[7-8]結(jié)果顯示，DCLK1蛋白高表達(dá)與胰腺癌惡性程度增高密切相關(guān)，但具體研究DCLK1長、短亞型對胰腺癌生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道。本研究將DCLK1長型亞型1和DCLK1短型亞型4分別轉(zhuǎn)染進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞，構(gòu)建DCLK1長、短亞型的穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系，研究各亞型對胰腺癌細(xì)胞增生的影響，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

空載(PCMV6-AC-GFP)、DCLK1亞型1和DCLK1亞型4質(zhì)粒購于美國Origene公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Ausbian胎牛血清購自上海威正翔禹生物科技有限公司。RNA抽提試劑Trizol和LipofectamineTM3 000 試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自日本Takara公司，所有引物均由上海生工公司合成。G418購自北京Solarbio公司。JNK抑制劑SP600125購自上海碧云天公司。Western blotting法檢測所用的RIPA蛋白裂解液、蛋白抑制劑和PMSF均購自南京恩晶生物有限公司，5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜和辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物均購自美國Millipore公司，DCLK1抗體購自美國Abcam公司，其余一抗均購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多功能實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(real-time cell analysis, RTCA)由美國ACEA 生命科學(xué)公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc-1、Bxpc-3、PANC-1均購自美國ATCC細(xì)胞庫。PANC-1細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基[含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS]，Aspc-1和Bxpc-3用RPMI培養(yǎng)基[含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS]，在37 ℃ 和5%(體積分?jǐn)?shù))CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。JNK抑制劑SP600125(溶解度為15 g/L)溶于DMSO中，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至0、40、80 μmol/L 3個(gè)濃度加入到細(xì)胞中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

分別將PAMV6-AC-GFP、DCLK1亞型1、DCLK1亞型4 3種質(zhì)粒按照LipofectamineTM3 000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染進(jìn)PANC-1細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含900 μg/mL G418的培養(yǎng)基篩選至少20 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)的3個(gè)細(xì)胞系，分為3組：PCMV6-AC-GFP(Control組)、DCLK1亞型1過表達(dá)(DCLK1 iso1 OE組)、DCLK1亞型4過表達(dá)(DCLK1 iso4 OE組)。

1.4 Western blotting法檢測蛋白表達(dá)

待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%，用預(yù)冷PBS洗滌兩次，用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒測定其濃度。取50 μg蛋白在10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，用0.2 μmol/L的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶中封閉1 h后，孵育一抗并4 ℃過夜。隨后，用TBST洗膜3次，每次5 min，再用相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，最后凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.5 qRT-PCR檢測DCLK1的表達(dá)

用Trizol提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。DCLK1長型(DCLK1-L)、DCLK1短型(DCLK1-S)和內(nèi)參GAPDH的引物探針由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：GAPDH-F: 5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，GAP DH-R: 5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′；DCLK1-L-F: 5′-GGAGTGGTGAAACGCCTGTAC-3′，DCLK1-L-R: 5′-GG TTCCATTAACTGAGCTGG-3′；DCLK1-S-F: 5′-ACACTAAGACTGTGTCCATGTTAGAACTC-3′，DCLK1-S-R: 5′-AAG CCTTCCTCCGACACTTCT-3′。

按照qRT-PCR說明書進(jìn)行反應(yīng)，體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用qRT-PCR分析軟件分析CT值，目的基因RNA相對量=2-ΔΔCT, ΔΔCT=待測樣本(CT目的基因-CT內(nèi)參)-對照組(CT目的基因-CT內(nèi)參)。

1.6 RTCA檢測細(xì)胞增生能力

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，每孔6 000個(gè)細(xì)胞種于平板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每15 min記錄一次數(shù)據(jù)，在37 ℃ 5% (體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h，得到生長曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分析DCLK1亞型1/4在胰腺癌3株細(xì)胞系中的mRNA基礎(chǔ)表達(dá)量時(shí)，使用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行方差分析，其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCLK 1長、短亞型穩(wěn)定過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞系的構(gòu)建

用qRT-PCR和Western blotting法分別檢測胰腺癌3種細(xì)胞系中DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的表達(dá)，在PANC-1細(xì)胞中，DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的表達(dá)水平最低(圖1A和1B)。因此，本研究選擇PANC-1細(xì)胞株用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過qPCR和Western blotting法分析證實(shí)，PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4質(zhì)粒后，其DCLK1表達(dá)水平與Control組相比明顯升高(t=32.640，P<0.001；t=17.027，P=0.002)，成功構(gòu)建了DCLK1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系(圖1C和1D)。

圖1 構(gòu)建DCLK1 亞型1和4穩(wěn)定過表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系Fig.1 Construction of DCLK1 isoform 1 and 4 overexpression stable cell lines in pancreatic cancer

A: mRNA expression of DCLK1 isoform 1 and 4 in three pancreatic cancer cell lines (AsPC-1, Bxpc-3, PANC-1);B: protein expression of DCLK1 isoform 1 and 4 in three pancreatic cancer cell lines;C: DCLK1 iso1/4-overexpressing (DCLK1 iso1 OE， DCLK1 iso4 OE) PANC-1 cells demonstrate a significantly upregulation in DCLK1 protein;D: DCLK1 iso1/4-overexpressing (DCLK1 iso1 OE， DCLK1 iso4 OE) PANC-1 cells demonstrate a significantly upregulation in DCLK1 mRNA expression；**P<0.01，***P<0.001;DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

2.2 DCLK1長、短亞型對PANC-1細(xì)胞體外增生能力的影響

利用RTCA檢測胰腺癌細(xì)胞的增生能力。Control組與DCLK1亞型1過表達(dá)組60 h時(shí)的細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)值分別為0.560±0.037，0.883±0.011；80 h時(shí)的CI值分別為0.835±0.032，1.584±0.120；100 h時(shí)的CI值分別為1.061±0.070，2.739±0.234；120 h時(shí)的CI值分別為1.780±0.007，3.857±0.007。Control組與DCLK1 亞型4過表達(dá)組60 h時(shí)的CI值分別為0.769±0.010，1.185±0.028；80 h時(shí)的CI值分別為1.074±0.018，1.799±0.042；100 h時(shí)的CI值分別為1.538±0.231，2.788±0.223；120 h時(shí)的CI值分別為2.020±0.060，3.782±0.290。DCLK1 亞型1和DCLK1 亞型4的過表達(dá)均可以顯著促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增生能力(圖2)。

圖2 DCLK1亞型1和4過表達(dá)對PANC-1細(xì)胞增生能力的影響Fig.2 Effect of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the ability of proliferation in PANC-1 cells

A：DCLK1 isoform 1 overexpression (DCLK1iso1 OE)；B： DCLK1 isoform 4 overexpression (DCLK1iso4 OE)；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

2.3 DCLK1長、短亞型激活PANC-1細(xì)胞中的JNK通路

Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，DCLK1亞型1和DCLK1亞型4的過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的磷酸化水平(t=16.480，P=0.004；t=44.109，P=0.01)，而對細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和p38磷酸化水平無顯著影響(t=3.423，P=0.076；t=1.431，P=0.289；t=2.234，P=0.155；t=0.512，P=0.660)(圖3A)。為了進(jìn)一步證實(shí)DCLK1對胰腺癌JNK通路的激活作用，同時(shí)檢測了JNK通路下游靶標(biāo)的蛋白表達(dá)水平，JNK通路下游靶標(biāo)如C-MYC(t=10.547，P=0.009；t=12.648，P=0.006)、CD44(t=7.849，P=0.016；t=18.008，P=0.003)和CyclinD1

圖3 DCLK1亞型1和4過表達(dá)對JNK通路的影響Fig.3 Effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on JNK pathway

A: effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the protein levels of MAPK pathways such as JNK, ERK and p38;B: effects of overexpression of DCLK1 isoform 1 and 4 on the protein levels of downstream molecular markers such as C-MYC, CD44 and CyclinD1 in JNK pathway；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vscontrol group；JNK：c-Jun N-terminal kinase；ERK：extracellular regulated protein kinases；MAPK：mitogen-activated protein kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1iso1OE： DCLK1 isoform 1 overexpression；DCLK1iso4OE：DCLK1 isoform 4 overexpression.

(t=47.437，P=0.000；t=336.459，P=0.000)的表達(dá)也顯著升高(圖3B)。

2.4 SP600125抑制JNK通路可顯著降低DCLK1的促增生能力

Western blotting法分析結(jié)果顯示，在DCLK1 亞型1和DCLK1亞型4過表達(dá)的PANC-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，用不同濃度的JNK特異性抑制劑SP600125(40、80 μmol/L)處理細(xì)胞后，可以顯著抑制JNK的磷酸化。同時(shí)JNK通路抑制可以顯著下調(diào)DCLK1對JNK通路下游靶標(biāo)CMYC、CD44和CyclinD1的激活(圖4A)，這些蛋白標(biāo)志物差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。同時(shí)RTCA檢測結(jié)果顯示，DCLK1亞型1過表達(dá)細(xì)胞系中，SP600125(0 μmol/L)組與SP600125(40 μmol/L)組60 h時(shí)的CI值分別為：5.055±0.175，3.816±0.460；80 h時(shí)的CI值分別為：6.683±0.320，5.538±0.614；100 h時(shí)的CI值分別為7.652±0.442，6.544±0.327；120 h時(shí)的CI值分別為：7.506±0.472，6.058±0.178。DCLK1亞型4過表達(dá)細(xì)胞系中，SP600125(0 μmol/L)組與SP600125(40 μmol/L)組60 h時(shí)的CI值分別為：4.788±0.206，2.465±0.443；80 h時(shí)的CI值分別為：6.443±0.480，4.066±0.668；100 h時(shí)的CI值分別為8.684±0.799，5.321±0.554；120 h時(shí)的CI值分別為：8.476±0.520，5.336±0.391(圖4B)。

圖4 JNK抑制劑SP600125對DCLK1亞型1和4過表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞增生能力的影響Fig.4 Effects of JNK inhibitor SP600125 on the proliferation of DCLK1 isoform and 4 overexpressed pancreatic cancer cells

A: treatment with the indicated concentrations of JNK inhibitor SP600125 (0, 40, 80 μmol/L) on the downstream molecular of JNK pathway at protein level in PANC-1 DCLK1 isoform 1 and 4 overexpression cells;B: proliferation abilities of PANC-1 DCLK1 isoform 1 and 4 overexpressed cells after treatment with SP600125；DCLK1 isoform 1 overexpression (DCLK1iso1 OE), DCLK1 isoform 4 overexpression (DCLK1iso4 OE)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vscontrol group；JNK：c-Jun N-terminal kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

表1 SP600125抑制JNK通路后其下游蛋白標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)分析Tab.1 Statistical analysis of downstream protein markers after SP600125 inhibits JNK pathway

JNK：c-Jun N-terminal kinase；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是人類癌細(xì)胞存活、播散以及抵抗藥物治療的關(guān)鍵途徑[7]。DCLK1是公認(rèn)的腸道和胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物，在各種實(shí)體腫瘤(包括結(jié)直腸、胰腺、乳腺和前列腺)中均有上調(diào)[8-10]。研究[11-12]顯示，由于啟動(dòng)子選擇的差異，人類DCLK1基因可編碼形成具有不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的剪接異構(gòu)體。雖然尚未對這些亞型的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)的研究，但研究提示這些異構(gòu)體可能具有不同的亞細(xì)胞定位，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。本研究分別用空載PCMV6-AC-GFP、DCLK1 isoform 1和DCLK1 isoform 4 3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本研究探討了DCLK1長、短亞型對胰腺癌細(xì)胞增生能力的影響及其作用機(jī)制。RTCA結(jié)果表明，DCLK1長、短亞型均促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增生。通過評估DCLK1不同亞型對MAPK通路中JNK、ERK和p38 3個(gè)主要亞家族的影響，本研究顯示JNK通路是PANC-1細(xì)胞系中DCLK1長、短亞型的主要作用靶點(diǎn)。JNKs是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增生、分化、存活和死亡等多種生理過程的重要蛋白激酶分子，JNKs的持續(xù)激活參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[13]。以往研究[14-16]證實(shí)，JNK信號(hào)通路激活可以上調(diào)C-myc、CyclinD1和CD44等基因的表達(dá)，這些基因在胰腺癌的增生和自我更新中發(fā)揮重要作用。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證DCLK1靶向激活JNK通路，本研究檢測了DCLK1長、短亞型對JNK通路下游分子的影響，發(fā)現(xiàn)DCLK1過表達(dá)同時(shí)增強(qiáng)了JNK通路下游的靶點(diǎn)如C-myc、CD44和CyclinD1基因的表達(dá)。所有結(jié)果都支持DCLK1長、短亞型激活胰腺癌的JNK通路。

筆者推測，DCLK1長、短亞型通過激活JNK通路增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增生能力。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究用JNK特異性抑制劑SP600125抑制JNK通路，然后評估JNK被抑制后對DCLK1誘導(dǎo)的腫瘤增生能力的影響。Western blotting法檢測顯示，在DCLK1 亞型 1和DCLK1 亞型 4過表達(dá)的PANC-1細(xì)胞系中，JNK磷酸化及JNK通路下游分子如CMYC、CD44和CyclinD1的表達(dá)量均顯著降低。同時(shí)RTCA結(jié)果顯示，特異性抑制JNK后顯著下調(diào)了DCLK1長、短亞型的促增生能力。綜上所述，DCLK1長、短亞型通過激活JNK通路促進(jìn)胰腺癌的增生能力，從而加速胰腺癌的發(fā)生與進(jìn)展。