， ，，

充填體邊緣的菌斑產酸引起繼發(fā)齲，是充填材料脫落的主要原因[1]。復合樹脂具有優(yōu)良的美學效果，簡便的臨床操作過程，近年來廣泛應用于修復牙體缺損[2]。研究表明，復合樹脂材料表面較其他修復材料更容易堆積菌斑[3]。復合樹脂通過牙本質粘接劑粘接到牙體組織，理想的牙本質粘接劑能夠在復合樹脂的邊緣起到抗菌作用，防止繼發(fā)齲的發(fā)生[4]。近年來，季銨鹽類單體被添加到牙本質粘接劑中，使粘接劑具有較強的抗菌性能[5]。

唾液蛋白吸附于牙齒或者充填體表面形成獲得性膜，是形成菌斑的先決條件[6]。因此，如果牙本質粘接劑具有抗蛋白附著功能，則可以有效地限制菌斑的形成，降低繼發(fā)齲的發(fā)生。甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)是一類常見的具有抗蛋白附著和細菌粘附功能的生物復合物，已經被廣泛應用于臨床[7-9]。有研究將MPC和一種新型季銨鹽抗菌單體甲基丙烯酸十六烷基二甲銨(dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMAHDM)添加到牙本質粘接劑中使其具有很強的抗蛋白附著和抗菌功能[10]。

研發(fā)具有再礦化功能的牙本質粘接劑是對抗繼發(fā)齲發(fā)生的另一個有效途徑，無定形磷酸鈣納米顆粒(nanoparticles of amorphous calcium phosphate,NACP)是通過霧化干燥技術合成的，NACP釋放的鈣、磷離子與傳統(tǒng)的磷酸鈣復合體相似，但具有更優(yōu)的機械強度[11-12]。本研究將MPC、DMAHDM和NACP添加到牙本質粘接劑中，從而研發(fā)出一種具有抗蛋白附著、抗菌和再礦化作用的多功能牙本質粘接劑，并對其牙本質粘接強度、抗蛋白附著和抗菌性能進行評價。

1 材料和方法

1.1 含有MPC、DMAHDM和NACP的粘接系統(tǒng)的制備 商品名為SBMP(Scotchbond Multi-Purpose)牙本質粘接劑(美國3M公司)作為載體粘接系統(tǒng)，來測試添加MPC、DMAHDM和NACP的效果。根據(jù)前期研究結果，MPC(美國Sigma-Aldrich公司)粉末以質量分數(shù)為7.5%的比例添加到SBMP底膠和粘結劑中[10]。

使用改良門舒特金法制備DMAHDM，由叔胺基與有機鹵化物發(fā)生反應[13]。根據(jù)前期研究結果，DMAHDM以質量分數(shù)為5%的比例添加到SBMP底膠和粘結劑中[10]。

使用霧化干燥技術合成NACP。將碳酸鈣(美國Fisher公司)和無水磷酸氫鈣(美國Baker Chemical公司)溶解到乙酸中，以獲得終濃度分別為8 mmol/L和5.333 mmol/L的鈣離子和磷離子，Ca/P摩爾比為1.5，與無定型磷酸鈣(amorphous calcium phosphate,ACP)中一樣。將此溶液噴入到加熱的噴霧干燥裝置中，通過靜電沉淀器收集干燥的ACP納米顆粒(美國Air Quality公司)，獲得平均粒徑為116 nm的粉末狀NACP[11]。NACP添加到底膠中會降低粘接強度，因此NACP以質量分數(shù)為20%的比例添加到SBMP粘結劑中[12]。未添加MPC、DMAHDM和NACP的SBMP作為對照組。

1.2 牙本質剪切粘接強度的測試 經患者知情同意，簽署知情同意書。人無齲第三磨牙用金剛鉆鋸(美國Isomet公司)垂直地削掉牙冠釉質，露出牙本質表面。用粒度320目的金剛砂紙沿與牙長軸垂直的方向磨掉所有牙冠釉質[13]。牙本質表面用含37%磷酸的凝膠酸蝕15 s，用蒸餾水沖洗15 s，用刷頭將底膠涂在牙本質表面上，并擦拭15 s，再用刷頭將粘接劑涂在底膠表面上，并擦拭15 s，用流動空氣吹干2～3 s，然后光固化10 s。將直徑為4 mm，厚度為1.5 mm的不銹鋼環(huán)壓在粘接劑處理過的牙本質表面，環(huán)的中央孔中填入復合樹脂(美國Caulk/Dentsply公司)，光固化60 s[14]。試件在37 ℃蒸餾水中儲存24 h，用萬能材料試驗機測試牙本質剪切粘接強度SD[12]，刀頭刃端與電腦控制的萬能材料測試機(美國MTS公司)相連，并保持與復合樹脂-牙本質粘接界面平行，以0.5 mm/min的速度加力直到粘接面斷裂。SD的計算公式為：SD=4P/(πd2)，其中P為斷裂時的載荷，d是復合樹脂的直徑(即中央孔直徑)。每組10個試件。

1.3 抗蛋白附著性能的測試 對于抗蛋白和抗菌性能的測試，試件的制備應用96孔板的封蓋，先將10 μL的底膠涂抹于底部，吹干后將20 μL的粘接劑涂抹在底膠上，用賽璐珞條形成光滑表面，光固化30 s，最終形成直徑8 mm、厚度0.5 mm的圓片形試件[10,13]。將試件浸入蒸餾水，攪拌1 h，以除去任何未固化的單體。所有試件干燥并用環(huán)氧乙烷消毒(型號Anprolene AN 74i，美國Andersen Products公司)。

雙辛丁酸法測試試件表面蛋白的附著量。每個試件在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡2 h，然后再將試件浸泡在濃度為4.5 g/L的牛血清蛋白溶液中(美國Sigma-Aldrich公司)，在37 ℃條件下浸泡2 h。將試件在PBS中漂洗5 min，然后將試件放入含有1%十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中，超聲振蕩20 min[9-10]。應用蛋白質分析試劑盒(美國Fisher Scientific公司)測試PBS溶液中的蛋白質濃度，從而計算附著在試件表面的蛋白質的量。每組10個試件。

1.4 人唾液的收集 經患者知情同意，簽署知情同意書。人唾液被證明是體外培養(yǎng)菌斑生物膜的理想來源，它能保持體內牙菌斑的復雜性和異質性[15]。選擇10名擁有天然牙列，無活動性齲病或牙周病的健康成年人作為唾液的捐贈者。捐贈人在過去的3個月內沒有使用過抗生素，捐贈唾液前24 h不刷牙，并在捐贈唾液前至少2 h禁飲食。捐贈者在咀嚼封口膜的過程中收集分泌的刺激性唾液，并置于冰上。從每位捐贈者的唾液樣本中取出等量的唾液混合，混合的唾液在無菌甘油中稀釋至終濃度為70%，儲存于-80 ℃冰箱[16]，用于體外培養(yǎng)人全菌菌斑生物膜。

1.5 菌斑生物膜的形成和活/死細菌染色 將上述混合唾液以1∶50的比例稀釋于McBain培養(yǎng)基中作為人全菌生物膜的接種液。McBain培養(yǎng)基中含有粘蛋白，2.5 g/L；細菌蛋白胨，2.0 g/L；胰蛋白胨，2.0 g/L；酵母提取物，1.0 g/L；氯化鈉，0.35 g/L；氯化鉀，0.2 g/L；氯化鈣，0.2 g/L；鹽酸半胱氨酸，0.1 g/L；血紅素，0.001 g/L；維生素K1，0.000 2 g/L，材料均購自美國Sigma-Aldrich公司，pH值調整為7[17]。將接種液在37 ℃下，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24孔培養(yǎng)板每個孔放入一個試件，各孔中加入1.5 mL接種液，在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后將試件轉移至新的24孔板中，用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。16 h后，將試件轉移至新的24孔板中用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終在試件表面形成人全菌生物膜[10,12-13]。

將培養(yǎng)2 d的試件在PBS中輕柔漂洗3次，用活/死細菌生存力試劑盒(美國Molecular Probes公司)進行染色[10,12]。Syto 9將活細菌染色，產生綠色熒光；細胞膜受損的細菌會被碘化丙啶染色，產生紅色熒光；接近或重疊的死/活細菌會顯示出橙黃色。使用熒光顯微鏡(型號TE2000-S，日本Nikon公司)觀察染色的生物膜。每組6個試件，每個試件隨機選取3幅圖，每組試件一共18幅圖。

1.6 生物膜代謝活力的檢測 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]法是一種比色分析法，測量黃色的四唑MTT被酶催化還原為紫色的甲臜。將培養(yǎng)2 d的試件轉移到新的24孔板里，然后將1 mL的MTT染料加入到每個孔中，并在37 ℃下，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。然后將試件轉移到新的24孔板中，加入1 mL二甲亞砜中，并在室溫下避光溫和攪拌，培養(yǎng)20 min?；旌暇鶆蚝?，從每個孔中吸取200 μL的二甲亞砜溶液轉移到96孔板中，用酶標儀(型號SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司)在540 nm處測量吸光度。吸光度越高，表明甲臜濃度越高，意味著試件表面的生物膜代謝活性越高[10,12]。

1.7 生物膜乳酸產量的測定 將培養(yǎng)2 d的試件在半胱氨酸蛋白胨水中漂洗，以去除疏松的細菌。然后將試件轉移到新的24孔板，每孔內加入含0.2%蔗糖的緩沖蛋白胨水溶液。將其在37 ℃下，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使生物膜產乳酸。然后收集緩沖蛋白胨水溶液，用酶標儀在340 nm處測量吸光度，做乳酸產量分析[10,12]。每組10個試件。

2 結果

2.1 2組間的牙本質剪切粘接強度和蛋白附著量 實驗組和對照組間的牙本質剪切粘接強度比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.426)。實驗組的蛋白附著量顯著低于對照組(P=0.000)，大約是對照組的5%，表明實驗組具有較強的抗蛋白附著功能。表1。

2.2 2組試件表面菌斑的代謝活性和乳酸產量 實驗組試件表面菌斑的代謝活性和乳酸產量顯著低于對照組(P=0.000)，大約是對照組的5%，表明實驗組具有較強的抗菌性能。表2。

表1 粘接強度和蛋白附著量(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 菌斑代謝活性和乳酸產量(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 2組試件表面細菌粘附的定性比較 對照組試件表面覆蓋大量的活細菌，呈綠色熒光。實驗組試件表面的細菌粘附量明顯少于對照組，且主要為死細菌，呈紅/橙色熒光。圖1。

圖1 菌斑生物膜活/死細菌染色圖(n=6)

3 討論

本研究將MPC、DMAHDM和NACP添加到牙本質粘接劑中，并對其粘接強度，抗蛋白附著和抗菌效果進行了研究。結果表明，與商品化的粘接劑相比，實驗組在不影響牙本質粘接強度的前提下，具有明顯地抗蛋白附著和抗菌功能，因此含有MPC、DMAHDM、NACP的粘接系統(tǒng)能夠在牙體-修復體邊緣，有效減少蛋白質的附著和細菌的粘附，從而抑制菌斑形成。

MPC具有較強的抗蛋白附著和抗細菌粘附的功能，其原因是由于MPC具有很強的親水性，在含水的MPC聚合物中有大量的游離水，而無結合水。結合水會導致蛋白質的附著，而游離水可以有效地抵抗蛋白質的附著[7-8]。本研究結果顯示，含有MPC的牙本質粘接劑具有較強的抗蛋白附著的功能，其蛋白質附著量約為對照組的5%。蛋白質是細菌粘附的媒介，因此降低蛋白質附著量，可以有效地減少菌斑的形成。

季銨鹽類的單體具有較強的抗菌性[4-5]。通過和細胞膜結合，季銨鹽可導致細菌破裂，進而引起細胞質的泄露。當帶負電荷的細菌細胞接觸帶正電荷的季胺N+離子時，電荷平衡受到干擾，細菌可以在其自身的滲透壓作用下破裂[18]。長的陽離子聚合物可以像針刺破氣球一樣，穿透細菌細胞破壞細胞膜[19]。因此，碳鏈長度需要足夠長，以穿透細胞膜。有研究比較了不同碳鏈長度對季銨鹽單體抗菌性能的影響，結果表明碳鏈長度為16個碳的DMAHDM具有最強的抗菌性能[13]。此外，季銨鹽的抗菌機制為接觸性抗菌[4-5,18]，有研究報道含有季銨鹽單體的抗菌復合樹脂表面覆蓋唾液蛋白后，使得季銨鹽單體無法接觸細菌，從而降低材料的抗菌性能[18,20]。本研究將MPC和DMAHDM同時添加到牙本質粘接劑中，由于MPC有效地減少了蛋白質的附著，因此增加了DMAHDM抗菌性能。本研究結果顯示，實驗組表面的細菌粘附量明顯少于對照組，且主要為死細菌。實驗組菌斑的代謝活性和乳酸產量大約是對照組的5%，表明實驗組具有極強的抗菌性。

磷酸鈣復合樹脂及牙本質粘接劑，其本身不具有強的抗菌性能，但可以釋放超飽和態(tài)的鈣、磷離子使牙體硬組織的病損區(qū)域發(fā)生再礦化。傳統(tǒng)的磷酸鈣復合樹脂中的磷酸鈣填料粒徑約在1～55 μm。本研究通過霧化干燥技術合成的NACP的粒徑大小僅有100 nm左右。NACP釋放的鈣、磷離子與傳統(tǒng)的磷酸鈣復合體相似，但其機械強度是傳統(tǒng)磷酸鈣復合樹脂的近2倍。NACP復合樹脂有一定的“智能性”，它在酸性環(huán)境里會大量釋放出鈣、磷離子，也就是在最需要鈣、磷離子以對抗細菌產酸和防止齲壞發(fā)展的最佳時機。研究表明，含20%NACP的復合樹脂能夠中和酸，并將環(huán)境pH值從致齲的4提高到安全的6.5[11]。因此，本研究中同時添加MPC、DMAHDM和NACP到牙本質粘接劑中，以期能夠起到抗蛋白附著、抗菌、中和酸和促進再礦化的作用。這種添加多重有效成分(MPC是抗蛋白附著成分，DMAHDM是抗菌成分，NACP是再礦化成分)的方法在牙本質粘接劑中具有廣泛的應用前景。