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REGγ基因?qū)賀EG/11S蛋白酶體激活因子家族成員，也被稱為PSME3或PA28γ，可結(jié)合并激活20S蛋白酶體，以非泛素或非ATP依賴方式促進類固醇受體輔助活化因子-3、p21、p16等靶蛋白降解[1]。REGγ基因在結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，或有轉(zhuǎn)移抑制作用[2-3]，但針對其在甲狀腺癌中表達的研究國內(nèi)相對鮮見。本研究分別檢測REGγ基因在正常甲狀腺組織、甲狀腺良性病變組織及甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)組織中的表達情況，分析REGγ基因異常表達與PTC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)患者知情同意，簽署知情同意書。收集2015年1月—2018年6月成都市第二人民醫(yī)院手術(shù)切除甲狀腺標本103例，經(jīng)臨床病理明確診斷，其中PTC 59例，未分化癌(undifferentiated carcinoma，UTC)6例，濾泡癌(follicular carcinoma，F(xiàn)TC)4例，濾泡性腺瘤(follicular adenoma，F(xiàn)A)19例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(nodular goiter，NG)15例；男性患者32例，女性患者71例；年齡20～74歲，中位年齡45歲。PTC患者腫瘤直徑<2 cm者46例，≥2 cm者13例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。距病灶2 cm處取癌旁組織14例作為正常對照。部分標本離體30 min內(nèi)置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，剩余組織經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋切片。

1.2 實時定量-PCR(real-time PCR，RT-PCR)法檢測REGγ mRNA表達 ①根據(jù)TRIzol試劑盒(美國Gibco-BRL公司)說明書提取總RNA，分析純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Primer 5軟件設(shè)計REGγ引物，以5′-GCCTGTATCAAAGTCACCAAA-3′為上游引物，5′-CAGGAGCAGGAAAGCAAAG-3′為下游引物，產(chǎn)物273 bp。每份標本以β-actin為內(nèi)參對照，以5′-CTCATTGCCAATGGTGST-3′為上游引物，5′-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′為下游引物，產(chǎn)物170 bp。引物均由深圳華大基因公司設(shè)計完成。同管擴增，總反應(yīng)體系12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。②取10 μL PCR擴增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳；置紫外燈下拍照行面積灰度掃描，將密度表示其表達量；計算目的基因RT-PCR產(chǎn)物光密度容積與β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物光密度容積的比值，將其作為目的基因mRNA的相對含量。③使用3100型全自動遺傳分析儀測定PCR產(chǎn)物序列，并通過Blast程序?qū)⒔Y(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行同源性比較。

1.3 免疫組化檢測REGγ蛋白表達 ①參照試劑操作說明書，使用EnVision兩步法用乙二胺四乙酸緩沖液微波抗原修復11 min。采用扁桃體作為已知陽性組織切片做陽性對照，采用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗做陰性對照?？贵w及EnVision試劑盒均購自上海長嘉生物技術(shù)有限公司，DAB顯色液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。②結(jié)果判定：REGγ蛋白定位于細胞漿，呈棕黃至棕褐色染色為陽性細胞。采用網(wǎng)格計數(shù)法判定，隨機選取10個不重復視野，400倍光學顯微鏡下觀察免疫組化染色的陽性蛋白表達。染色強度評分：無著色計0分，淡黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分。陽性細胞評分：細胞陽性率<5%計0分，細胞陽性率5%～25%計1分，細胞陽性率26%～50%計2分，細胞陽性率51%～75%計3分，細胞陽性率>75%計4分。以染色強度評分+陽性細胞評分判定染色分級，陽性為≥3分，陰性為<3分。

2 結(jié)果

2.1 總RNA鑒定 提取總RNA光密度(optical density,OD)260/280值為1.8～2.0，提示RNA提取純度較高，可滿足RT-PCR試驗要求。1%瓊脂糖電泳可觀察到2條清晰的亮帶(28 s、18 s)，提示RNA完整未降解。

2.2 RT-PCR檢測 β-actin內(nèi)參基因片段長度170 bp，REGγ目的基因片段長度273 bp(圖1)；PTC組織中REGγ mRNA表達水平顯著高于FA、NG及癌旁正常甲狀腺組織，差異比較具有統(tǒng)計學意義(t分別為6.503，4.119，5.520，P<0.05)；PTC組織中REGγ mRNA表達水平與UTC、FTC組織比較，差異比較無統(tǒng)計學意義(t分別為0.630，0.352，P>0.05)；不同年齡、性別患者REGγ mRNA表達水平比較，差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑<2 cm患者REGγ mRNA表達水平顯著高于腫瘤直徑≥2 cm患者，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者REGγ mRNA表達水平顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

1：陰性對照；2：癌旁正常甲狀腺組織；3，4：FA；5，6：PTC；M：DNA標記圖1 RT-PCR法檢測REGγ mRNA表達

參數(shù)nREGγ mRNAREGγ蛋白陽性[n(%)]組織類型 PTC593.58±1.6039(66.10) UTC63.16±0.922(33.33) FTC43.29±1.482(50.00) FA191.07±0.894(21.05) NG151.84±0.610(0.00)癌旁正常甲狀腺組織141.18±0.510(0.00)臨床病理特征 年齡(歲)<45413.70±1.5629(70.73)≥45183.35±1.4410(55.56) 性別男性173.73±1.048(47.06)女性423.59±1.5128(66.67) 腫瘤直徑(cm)<2464.05±0.9537(80.43)≥2132.99±0.484(30.77) 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有212.94±1.299(42.86)無384.22±1.4334(89.47)

2.3 免疫組化 REGγ蛋白在癌旁正常甲狀腺組織中少量表達，主要表達在濾泡上皮細胞的胞漿；癌組織內(nèi)可見腫瘤細胞胞漿陽性著色；不同PTC病例呈不同程度異常表達(圖2)。PTC組織中REGγ蛋白陽性率為66.10%，高于UTC(33.33%)及FTC(50.00%)，但組間比較差異比較無統(tǒng)計學意義(χ2=2.511，0.427，P>0.05)；FA組織中REGγ蛋白陽性率為21.05%，NG及癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白均為陰性表達，與PTC組織比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=11.791，20.964，19.869，P<0.05)；不同年齡、性別患者REGγ蛋白陽性率比較，差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑<2 cm患者REGγ蛋白陽性率顯著高于腫瘤直徑≥2 cm患者，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者REGγ蛋白陽性率顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

A：PTC患者REGγ蛋白陽性表達；B：PTC患者REGγ蛋白陰性表達；C：癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白陰性表達圖2 PTC患者REGγ蛋白表達(EnVision×200)

2.4 REGγ mRNA與蛋白表達的關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析顯示，PTC組織中REGγ mRNA與蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.504，P<0.05)(圖3)。

圖3 REGγ mRNA與蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

隨著人們生活方式的改變，癌癥已上升至人類全部死因的第二位，肺癌、大腸癌、肝癌等惡性腫瘤已成為威脅患者生命的主要疾病[4-5]。目前，對于這些疾病尚無十分有效的治療手段，因此急需了解其發(fā)病機制，尋找新的藥物靶點，開發(fā)新型藥物。REGγ是一種蛋白酶體激活因子，在細胞周期和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控中起重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)REGγ基因在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌中均有過表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。然而，對REGγ基因在PTC中的表達水平以及表達調(diào)控機制尚不清楚。

REGγ-蛋白酶體屬REG/11S家族蛋白酶體激活因子，可結(jié)合并激活20S蛋白酶體，與19S激活因子-蛋白酶體以泛素和ATP依賴的經(jīng)典方式降解蛋白底物[7-8]。而REGγ-蛋白酶體降解蛋白質(zhì)底物卻并不需底物泛素化或ATP[9]。REGγ最初是在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中發(fā)現(xiàn)，其蛋白降解功能一直受到臨床關(guān)注，并形成了經(jīng)典的觀點，認為REGγ僅降解短肽片段，不能降解胞內(nèi)完整的蛋白[10-11]。但近年來Li等[12]研究推翻了這一觀點，其研究認為REGγ-蛋白酶體可降解與體內(nèi)多種腫瘤形成密切相關(guān)的類固醇受體輔助活化因子-3(SRC-3)。隨后Mao等[13]研究者相繼發(fā)現(xiàn)若干REGγ重要靶點(p53、p21、p16、p19)，進一步證實了REGγ的生物功能多樣性和重要性。Barton等[14]最近研究發(fā)現(xiàn)，REGγ缺陷小鼠因特異有絲分裂缺陷而體型消瘦，在果蠅內(nèi)發(fā)現(xiàn)REGγ對細胞分裂的效應(yīng)[15]，由此認為REGγ是細胞周期進程和細胞生存的重要調(diào)節(jié)因子，是致癌潛力的重要調(diào)節(jié)機制，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。本研究調(diào)查PTC病理組織中REG的表達，獲得REG在癌旁正常組織及腫瘤組織中的差異性表達信息，了解REG與PTC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，揭示REG異常表達的調(diào)控機制，結(jié)果顯示PTC組織中REGγ mRNA表達水平為(3.58±1.60)，顯著高于FA、NG及癌旁正常甲狀腺組織，提示REGγ在PTC中表達上調(diào)。

免疫組化結(jié)果顯示REGγ蛋白在FA中的表達介于PTC與正常甲狀腺組織之間的過渡性改變；PTC組織REGγ蛋白表達陽性的病例癌旁正常甲狀腺組織REGγ蛋白均為陰性。進一步行Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PTC組織中REGγ mRNA與蛋白表達呈正相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果提示REGγ基因表達與PTC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其表達水平上調(diào)可能是PTC病情進展的早期表現(xiàn)。

綜上所述，REGγ基因表達可能與PTC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，或可將REGγ表達水平上調(diào)作為評價腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移情況及預后評估的參考指標；PTC患者REGγ mRNA表達與REGγ蛋白水平的總體趨勢一致，可認為REGγ蛋白增加多依賴mRNA合成增加，但REGγ基因表達異?？赡苌婕盎蜣D(zhuǎn)錄等多個層面，其具體機制還有待進一步研究探討。