， ， ，， ，

凋亡異常是腫瘤細(xì)胞生存能力強(qiáng)的重要因素，許多惡性腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這種能力使癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的生存能力，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[1]。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率居于我國惡性腫瘤第2位[2]，對人民危害極大。胃癌具有進(jìn)展迅速、生長快的特點(diǎn)，患者的綜合治療效果不佳，預(yù)后較差[3]。胃癌具有這些惡性生物學(xué)特點(diǎn)其中重要原因在于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這種能力使胃癌細(xì)胞存活能力強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[4]。因此，如果能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的凋亡抵抗能力，使其易于凋亡，則有可能抑制腫瘤的進(jìn)展，從而改善治療效果及預(yù)后。近期通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤進(jìn)展的研究已成為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但迄今為止尚未取得突破性進(jìn)展。

胃癌細(xì)胞的凋亡是由多種基因、通路等共同作用而導(dǎo)致的，腫瘤細(xì)胞的凋亡情況是這些因素共同作用的結(jié)果[5]。近年來，有關(guān)微小RNA(microRNA,miRNA)與腫瘤關(guān)系的研究越來越受到關(guān)注。MiRNA是一種由22～28個堿基組成的單鏈核苷酸，在細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與胃癌關(guān)系密切，在胃癌的增殖、侵襲、凋亡過程中都發(fā)揮了重要作用[7-9]。MiR-514是miR家族的成員之一，有研究表明，miR-514在腎癌組織中表達(dá)降低，具有抑癌基因的功能[10]。但miR-514在胃癌中的表達(dá)情況還未見報道，miR-514在胃癌中是否發(fā)揮了作用及其機(jī)制也不明確。本研究分析miR-514表達(dá)與胃癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其作用機(jī)制，為胃癌治療新靶點(diǎn)的闡明做出貢獻(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2017年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普通外科住院并手術(shù)的胃癌患者80例，均經(jīng)開腹或腹腔鏡手術(shù)切除原發(fā)病灶。取新鮮的胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本，置于液氮保存?；颊咧心行?8例，女性22例；患者年齡36～80(61.4±10.3)歲。腫瘤長徑≥5 cm者53例，<5 cm者27例；腫瘤浸潤位于漿膜內(nèi)者42例，浸潤達(dá)漿膜外者38例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期者27例，Ⅲ、Ⅳ期者53例；腫瘤為中高分化者43例，低分化者37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者61例，陰性者19例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者9例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者71例。患者手術(shù)前均未接受過化療、放射治療、靶向治療等針對胃癌的治療?；颊卟缓喜?yán)重免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重感染及其他惡性腫瘤。研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者的知情同意。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑 人低分化細(xì)胞株MGC803購自中國科學(xué)院上海典型物保藏中心，于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保種傳代。MiR-514、Bcl-2、Bax、x連鎖凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptosis protein, xIAP)及內(nèi)參照基因U6、GAPDH的引物序列由上海生工生物公司合成。miR-514模擬物及陰性對照序列由美國Ambion公司合成。TaqMan Real-Time PCR試劑盒為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。PCR試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Invirtogen公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)為美國Sigma公司產(chǎn)品。實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(AB-7900型)為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 RT-PCR技術(shù)檢測miR-514及Bcl-2、Bax、xIAP表達(dá)水平 分別從組織及細(xì)胞株中提取總RNA，測定其濃度及純度。測定完畢后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗合成各靶基因的cDNA單鏈。然后取2 μL的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測miR-514應(yīng)用TaqMan RT-PCR試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒指示說明進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參照基因。Bcl-2、Bax、xIAP的基因檢測應(yīng)用PCR試劑盒按說明書進(jìn)行操作。建立20 μL的PCR體系，包括10 μL of 2×miRcute miRNA Premix(檢測miR-514)或SYBR Green Mix(檢測Bcl-2、Bax、xIAP基因)、上下游引物各0.5 μL、2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、DEPC處理水7 μL。進(jìn)行PCR循環(huán)，共進(jìn)行40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)水平，以目的基因的表達(dá)水平與內(nèi)參照基因的表達(dá)水平的比值代表目的基因表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及miR-514模擬物轉(zhuǎn)染、分組 MGC803細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，當(dāng)細(xì)胞處于生長期，融合達(dá)到60%～70%時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。細(xì)胞分為不轉(zhuǎn)染組(空白組)、miR-514模擬物轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染組)及陰性對照序列轉(zhuǎn)染組(陰性組)。按操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.5 MTT法檢測各組細(xì)胞活性 各組MGC803細(xì)胞調(diào)整濃度接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞為1×105個，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至附壁。實(shí)驗結(jié)束前4 h向各孔內(nèi)加入濃度為5 mg/mL的MTT共20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄去培養(yǎng)液，然后在每孔內(nèi)加入150 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。震蕩15 min后用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)，用光密度值(optical density, OD)代表細(xì)胞的活性。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞的凋亡率 各組MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。以磷酸鹽緩沖液漂洗、胰酶消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL加入到500 μL緩沖液中。分別加入10 μL of Annexin V-FITC和10 μL of Pl染液，繼續(xù)孵育15 min。將樣品上機(jī)檢測，每個樣品檢測105個細(xì)胞。計算細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織miR-514的表達(dá) 胃癌組織中miR-514的相對表達(dá)量為(0.3619±0.2103)，癌旁正常胃黏膜組織miR-514的相對表達(dá)量為(0.6943±0.3032)。胃癌組織中miR-514水平明顯低于癌旁正常胃黏膜組織(t=-8.0573,P<0.001)。

2.2 胃癌組織中miR-514表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床病理特征的關(guān)系 MiR-514表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(t=-2.5620,P=0.0123)，與性別、年齡、腫瘤長徑、浸潤深度、TNM分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均無關(guān)(P>0.05)。表1。

表1 胃癌組織中miR-514表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

例數(shù)(n)miR-150表達(dá)水平性別 男580.3697±0.2139 女220.3414±0.2037年齡 ≥60歲490.3562±0.1945 <60歲310.3708±0.2362腫瘤長徑 ≥5 cm530.3768±0.2105 <5 cm270.3326±0.2108浸潤深度 漿膜內(nèi)420.3336±0.1991 漿膜外380.3931±0.2204TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期270.3240±0.2119 Ⅲ～Ⅳ期530.3812±0.2088分化程度 中高分化430.3525±0.2265 低分化370.3728±0.1922淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽性610.3294±0.2084 陰性190.4662±0.1850遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 有90.3552±0.1924 無710.3627±0.2137

2.3 MiR-514轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株MGC803活性的影響 MiR-514模擬物轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MGC803后48 h檢測，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性(0.522±0.062)，陰性組細(xì)胞活性(1.108±0.145)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的活性明顯降低(P<0.05)。圖1。

注:?與陰性組比較,P<0.05圖1 miR-514模擬物轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株MGC803活性的影響

2.4 MiR-514轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株MGC803凋亡的影響 MiR-514模擬物轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MGC803后細(xì)胞的凋亡率明顯增高(F=36.451,P<0.001)。表2、圖2。

表2 各組人胃癌細(xì)胞株MGC803凋亡率情況

圖2 各組人胃癌細(xì)胞株MGC803的凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果)

2.5 MiR-514轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞株MGC803凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、xIAP的影響 轉(zhuǎn)染后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、xIAP的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高(均P<0.05)。圖3。

注：*與陰性組和空白組相比，P<0.05圖3 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、xIAP基因mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討論

胃癌是我國的高發(fā)惡性腫瘤之一，居各種惡性腫瘤發(fā)病率的第3位[11]。近年來發(fā)病率雖然略有下降，但總體療效并未獲得明顯改善，5年生存率一直在30%左右。迄今為止，外科手術(shù)仍被認(rèn)為是治療胃癌的最主要手段，但其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，也是胃癌患者的主要死因[12-13]。胃癌進(jìn)展迅速的重要原因之一在于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這種能力使胃癌細(xì)胞易于存活，難以被機(jī)體自身的抗體或外界的藥物殺滅，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。目前研究已證實(shí)胃癌細(xì)胞對鉑類化療藥物的耐藥形成主要來源于其具有的凋亡抵抗能力[14]，胃癌細(xì)胞的這種能力嚴(yán)重影響化療效果。因而近年來調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡已成為胃癌治療領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。由于胃癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控是由包括多種基因、通路蛋白、miR、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)等多種分子互相作用而形成的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控體系共同決定的，其機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未找到在網(wǎng)絡(luò)中存在的關(guān)鍵分子，因而胃癌凋亡調(diào)控也未取得突破性進(jìn)展。

在參與胃癌基因調(diào)控的分子中，近年來miR已受到越來越多的關(guān)注，并在胃癌研究中取得了很多成果。MiR屬于一類小RNA(small RNA)，一般長約22～28個核苷酸，不編碼蛋白質(zhì)；它普遍存在于生物界，具有保守性﹑基因簇集現(xiàn)象和時空特征等生物學(xué)特性。MiR的作用極為廣泛，參與了生物體的各種生命現(xiàn)象，如發(fā)育﹑細(xì)胞分化﹑增殖和凋亡途徑[15]。miR的作用在于它能調(diào)控成組的靶基因，因而與單個基因相比，miR具有更為強(qiáng)大的調(diào)控功能。迄今已發(fā)現(xiàn)多種miR在胃癌中存在異常表達(dá)并發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-30可以通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的自噬功能而減弱其耐藥性[16]。MiR-203a可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制胃癌細(xì)胞的增殖[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-93可以促進(jìn)胃癌的侵襲[18]。這些研究表明miR在胃癌中發(fā)揮了廣泛的調(diào)控作用，且作用的方式多樣，有的具有原癌基因的功能，有的具有抑癌基因的作用。深入研究miR在胃癌中的作用效果及機(jī)制有良好的前景。本研究中的miR-514也是近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關(guān)的miR之一，在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)降低，可能參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程[19]。本研究結(jié)果顯示，miR-514在胃癌組織中的表達(dá)水平比癌旁組織明顯減低，提示miR-514的表達(dá)缺失可能是胃癌發(fā)生及進(jìn)展的原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-514表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，存在淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的患者胃癌組織中miR-514表達(dá)更低，說明miR-514在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮了作用，有可能成為胃癌新的治療靶標(biāo)志。

有關(guān)miR-514在胃癌中作用的具體調(diào)控機(jī)制還不明確，因此我們進(jìn)一步檢測了在胃癌細(xì)胞株MGC803中過表達(dá)miR-514后細(xì)胞凋亡能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-514模擬物后MGC803細(xì)胞的凋亡率明顯升高，提示miR-514可能是通過調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。Bcl-2是細(xì)胞線粒體凋亡途經(jīng)中的主要基因，其主要功能是維持細(xì)胞穩(wěn)定、減少凋亡[20]。Bcl-2在細(xì)胞中可以通過多種途徑發(fā)揮其凋亡抵抗作用，在腫瘤中Bcl-2存在表達(dá)增高現(xiàn)象，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗的重要原因[21]。Bax則是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要基因，其主要作用是與Bcl-2結(jié)合成為二聚體，其中二者的比例決定了腫瘤細(xì)胞的凋亡程度[22]。在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控的研究中，選用合適的方法促進(jìn)Bax表達(dá)、從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前研究的一個重要領(lǐng)域。xIAP是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員之一，具有類似鋅指的結(jié)構(gòu)，在多種腫瘤組織中廣泛表達(dá)，其作用主要是通過直接或間接的作用調(diào)控caspase家族中的casepase-3、7、8、9而抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗[23]。進(jìn)一步檢測miR-514模擬物轉(zhuǎn)染前后MGC803細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、xIAP的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-514模擬物后MGC803細(xì)胞中Bcl-2、xIAP的mRNA表達(dá)明顯降低，而Bax的mRNA表達(dá)明顯增高，提示miR-514通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮了作用，但具體的機(jī)制還需要深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-514在胃癌組織中存在表達(dá)減低的現(xiàn)象，與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。miR-514可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax、xIAP的轉(zhuǎn)錄而使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抵抗，從而抑制胃癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胃癌進(jìn)展。本研究初步證實(shí)了miR-514在胃癌凋亡過程中的調(diào)控作用，但研究還不夠深入，需要進(jìn)一步的動物實(shí)驗予以證實(shí)，還需要全面的分子間調(diào)控研究進(jìn)行分析。