馮勝男

摘要：本實(shí)驗(yàn)采用單層牛津杯疊法，對(duì)酸菜汁中的防腐乳桿菌進(jìn)行檢測(cè)及篩選，得到一株優(yōu)勢(shì)抑菌乳酸菌，該菌具有良好的抑菌特性，對(duì)改良發(fā)酵酸菜品質(zhì)、延長(zhǎng)酸菜產(chǎn)品保質(zhì)期具有重大意義。

關(guān)鍵詞：酸菜加工;防腐;乳桿菌;檢測(cè)

1前言

發(fā)酵果蔬是日常飲食的一部分，具有很高的經(jīng)濟(jì)重要性。然而微生物的生長(zhǎng)繁殖造成這類產(chǎn)品的腐敗也是發(fā)酵果蔬行業(yè)上的一個(gè)主要問(wèn)題。通常認(rèn)為乳酸菌是安全的，乳酸菌被廣泛應(yīng)用在各類食品中，其生理功能和特點(diǎn)在食品加工中發(fā)揮了重要作用它們?cè)谑称饭I(yè)中的使用有助于減少添加化學(xué)防腐劑和強(qiáng)化熱處理，迄今為止，只有乳酸鏈球菌素是食品級(jí)細(xì)菌素。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類形態(tài)、代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同，可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的統(tǒng)稱，乳酸菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，如乳酸，乙酸和丙酸作為碳水化合物代謝的發(fā)酵終產(chǎn)物。據(jù)Ross等報(bào)道稱，這些弱有機(jī)物產(chǎn)酸導(dǎo)致酸性環(huán)境，抑制細(xì)菌和真菌，包括許多致病微生物和腐敗微生物的生長(zhǎng)，而B(niǎo)atish等^【1】研究發(fā)現(xiàn)這些弱有機(jī)酸的抗菌作用歸因于將pH降低至低于未分解有機(jī)物生長(zhǎng)和代謝抑制范圍的水平。研究報(bào)告表明乳酸菌有益人體健康，同時(shí)這些有益乳酸菌在食物中有很長(zhǎng)的使用歷史，它們產(chǎn)生一些拮抗性化合物，特別是能夠控制病原菌和有害的腐敗菌群，使用乳酸菌來(lái)控制霉菌生長(zhǎng)是物理和化學(xué)方法的替代，因?yàn)檫@些細(xì)菌已經(jīng)被報(bào)道具有強(qiáng)的抗微生物性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)一些復(fù)配防腐劑易引起致癌、致畸、致突變和引起食物中毒等問(wèn)題，其使用量越來(lái)越受到眾多國(guó)家的限制。同時(shí)從多地區(qū)多廠家的酸菜質(zhì)量抽查報(bào)告中顯示，不合格樣品屢屢增多，為防止微生物超標(biāo)而濫用或超劑量使用防腐劑是其主要原因。因此，在保證酸菜品質(zhì)的同時(shí)，如何安全、規(guī)范的使用防腐劑來(lái)延長(zhǎng)其保質(zhì)期成為了酸菜行業(yè)中函待解決的問(wèn)題，同時(shí)也是成為國(guó)內(nèi)外食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

近幾年來(lái)，為防止食品及農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)前、產(chǎn)后的腐敗變質(zhì)，主要的解決方法是添加化學(xué)防腐劑，用于防止食品在儲(chǔ)存^【2】、流通過(guò)程中主要由微生物繁殖引起的變質(zhì)而使用的食品添加劑，李佰秋等^【3】，研究Nisin與植酸復(fù)配對(duì)腌制蔬菜中G⁺腐敗菌的抑制效果。通過(guò)檢查與篩選酸菜發(fā)酵中的防腐乳桿菌，不僅能改良食品的品質(zhì)、延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，還可以抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也是未來(lái)防腐領(lǐng)域研究的重點(diǎn)^【4】。具有高抑霉?jié)摿Φ木昕捎糜谛率称返拈_(kāi)發(fā)，同時(shí)也有助于最終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。

2材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

大白菜、土豆，食鹽。抑菌試驗(yàn)的指示菌株：引起酸菜在發(fā)酵過(guò)程中霉變的白地霉（GeotrichumCandidum）;引起酸菜在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)醭的假絲酵母（Candida xestobii），復(fù)配菌株：前期實(shí)驗(yàn)篩選得到的亞硝酸鹽降解率高達(dá)94.2%的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室提供

2.2主要試劑與培養(yǎng)基

（1）試劑：鐵氰化鉀，乳酸，三氯乙酸，吡啶、鄰苯二酚紫、1.10-菲羅一水合物，胰蛋白酶、胃蛋白酶，L-半胱氨酸鹽酸鹽分析純級(jí)化學(xué)試劑;胰蛋白胨、酵母浸粉OXOID.LTD;（2）培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、馴化培養(yǎng)基：酸菜汁與MRS液體培養(yǎng)基的比例依次為1：9、1：4、3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1、1，通過(guò)榨取市售酸菜而獲得酸菜汁，馴化培養(yǎng)基經(jīng)121℃、15min滅菌備用（3）儀器：UV-1800型紫外分光光度計(jì);離心機(jī)、YXQ-LS-75G型高壓蒸汽滅菌鍋;SHP-250型恒溫培養(yǎng)箱等。

2.3防腐乳桿菌的篩選

（1）防腐乳桿菌的初篩：菌株的分離培養(yǎng)：取不同發(fā)酵時(shí)期的自然發(fā)酵的酸菜為分離樣，壓榨成汁，過(guò)濾取10mL濾液，用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，取0.1mL涂布于NA培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48h，每個(gè)梯度做三組平行，挑取單菌落于NA培養(yǎng)基中進(jìn)行畫線純化2-3次，4℃保藏備用;菌株發(fā)酵上清液的制備：在37℃下，將菌株接種到10mLMRS肉湯中活化2次，然后取200μL活化好的發(fā)酵液，接種到20mL新鮮無(wú)菌的MRS培養(yǎng)液中，37℃下生長(zhǎng)72h而不搖動(dòng)，最后，在7200 r/min，離心10min棄去菌體，即獲得菌株發(fā)酵上清液;牛津杯抑菌試驗(yàn)：指示菌活化3代后，以1%（v/v）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)36h后，將菌株的發(fā)酵液在4000 r/min離心10min后，收集發(fā)酵液，吸取0.2mL發(fā)酵上清液，利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定供試菌株發(fā)酵液的抑菌活性。

（2）防腐乳桿菌的復(fù)篩：排除有機(jī)酸對(duì)菌株抑菌的影響：測(cè)定方法參考張旭等^[77]的研究。取兩個(gè)小燒杯，倒入適量的蒸餾水，測(cè)定抑菌菌株發(fā)酵液的pH值，分別用36%乳酸和80%乙酸去調(diào)節(jié)蒸餾水的pH值，使其與抑菌發(fā)酵液的pH值相同，然后將抑菌發(fā)酵液在4000r/min，離心10min，取200μL發(fā)酵上清液做對(duì)照，做牛津杯抑菌試驗(yàn)，做3組重復(fù)。排除過(guò)氧化氫對(duì)菌株抑菌的影響：將過(guò)氧化氫酶添加到發(fā)酵上清液中，使過(guò)氧化氫酶的終濃度為5μg/mL，在30℃孵育2h，以未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液為對(duì)照組，用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性，并用直尺測(cè)量抑菌圈直徑。蛋白酶敏感性試驗(yàn)：將胰蛋白酶、胃蛋白酶分別溶解在經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后的發(fā)酵上清液中，使酶終濃度為5mg/L，在30℃孵浴2h，以稀釋相同倍數(shù)的發(fā)酵上清液做對(duì)照，做3個(gè)重復(fù)，采用牛津杯法測(cè)定抑菌活性，記錄抑菌圈直徑。

3結(jié)果與分析

通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳酸菌在發(fā)酵過(guò)中可能會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，如：乙酸、苯丙酸等，細(xì)菌素（Bacteriocin）^【5】是細(xì)菌在代謝過(guò)程中由核糖體合成，基因編碼的一類具有抑菌生物活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。因其高效、無(wú)毒、耐高溫、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性及良好的生物多肽或蛋白類物質(zhì)要篩選產(chǎn)細(xì)菌素的菌株^【6】，首先要排除干擾，再驗(yàn)證抑菌物質(zhì)是否為蛋白類抑菌物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明：初篩選出6株抑菌菌株，經(jīng)排除干擾后，篩選出1株菌株SC21乳酸菌，通過(guò)溫度、pH對(duì)菌株發(fā)酵上清液的影響以及發(fā)酵上清液對(duì)酶的敏感性的研究表明，發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有抑制作用。

參考文獻(xiàn)

[1]于紅，李佰秋. 食品防腐劑的使用[J]. 企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化，2007（3）：33-33.

[2].韓德權(quán)，王藝，孫慶申，等. 納他霉素提高酸菜感官品質(zhì)的研究[J]. 食品科學(xué)，2010，31（23）：314-316.

[3].何鵬暉，厙曉，錢楊，等. 發(fā)酵蔬菜中腐敗微生物及其防控的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（11）：374-378.

[4]沈娟，于中玉，仇建飛. 乳酸菌在食品發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2017（33）：125-125.

[5]冬天水果熱著吃-中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)-2013年第1期（2）

[6]陳德昭等.中國(guó)植物志（第三十六卷）.北京：北京科學(xué)出版社，1988.

（作者單位：和光食品（煙臺(tái)）有限公司）