蘇乾蓮 趙 武 周 恒 李 斌 梁家幸 何 穎 李曉玉 秦毅斌 盧冰霞 韋明松*

1.廣西獸醫(yī)研究所/ 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001；2.廣西畜牧研究所，南寧530001；3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005

羅非魚(yú)是我國(guó)出口量最大的養(yǎng)殖魚(yú)類，2012年我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖總產(chǎn)量為155 萬(wàn)t，出口量為36 萬(wàn)t，總產(chǎn)量和出口量穩(wěn)居全球第1 位。羅非魚(yú)一直被認(rèn)為易養(yǎng)且抗病力強(qiáng)，但近年來(lái)羅非魚(yú)病害頻繁發(fā)生且日趨嚴(yán)重，尤其是無(wú)乳鏈球菌病嚴(yán)重威脅著羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。水溫變化能引起鏈球菌基因表達(dá)差異，最終導(dǎo)致病原菌形態(tài)、代謝和毒力的改變[2]。研究表明[3]，水溫高于32 ℃時(shí)，羅非魚(yú)更易感染無(wú)乳鏈球菌。HSP70 是HSP 家族主要成員之一，HSP70 在正常細(xì)胞中水平較低，且高度保守，在應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高, 可作為應(yīng)激反應(yīng)和評(píng)價(jià)組織細(xì)胞處于危險(xiǎn)狀態(tài)的分子生物標(biāo)志，因此已成為HSP 中被關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。熱、冷、低氧、氧自由基、某些細(xì)菌及寄生蟲(chóng)感染等應(yīng)激因素均可誘導(dǎo)細(xì)胞HSP70 的表達(dá)，導(dǎo)致核蛋白變性、疏水區(qū)暴露并相互作用而聚合，此時(shí)，HSP70 從細(xì)胞質(zhì)迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與變性蛋白疏水區(qū)結(jié)合，從而限制了其相互聚合，并可使已聚合的蛋白解聚，恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。當(dāng)然，如果綜合應(yīng)激強(qiáng)度過(guò)大，造成細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)損傷和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，不但使HSP70 表達(dá)合成降低，而且會(huì)使HSP70 在細(xì)胞內(nèi)的分布改變。因此，就無(wú)乳鏈球菌在夏季高水溫條件下感染羅非魚(yú)過(guò)程中HSP70 所發(fā)揮的重要作用進(jìn)行研究，對(duì)于弄清為何在高溫時(shí)期羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病較常溫時(shí)期更嚴(yán)重的現(xiàn)象十分必要，同時(shí)對(duì)于制定合理控制無(wú)乳鏈球菌病的策略具有重要意義。在壓力環(huán)境中，基礎(chǔ)HSP70 水平的增加可能與個(gè)體健康狀況降低有關(guān)[5]。HSP 的誘導(dǎo)和適應(yīng)性的這種關(guān)聯(lián)已經(jīng)被證明在發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖的特征上[6-8]。熱休克蛋白（HSPs）的分子家族在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)激條件下在爪蟾和果蠅等模式生物中已經(jīng)得到深入研究[9]，特別是70 ku（HSP70）家族，正常（非應(yīng)激）條件下在細(xì)胞中組成性表達(dá)，并起到分子伴侶的作用，以防止其他蛋白質(zhì)形成不適當(dāng)?shù)木奂３斯δ芡?，HSP還參與應(yīng)激細(xì)胞和生物體的一般保護(hù)[10]。許多研究報(bào)告指出，有機(jī)體暴露于諸如極端溫度、污染物、缺氧、寄生、捕食或競(jìng)爭(zhēng)等各種壓力源中，都會(huì)引起HSP70 表達(dá)的可逆增加，從而保護(hù)有機(jī)體免受細(xì)胞損傷[11-14]。HSP70 在魚(yú)類適應(yīng)鹽度變化中的作用在試驗(yàn)上也有很好的記載[15-16]。在銀海鯛中，HSP70 的鰓部表達(dá)隨著低滲透或高滲透性休克而增加[17]。HSP70 在羅非魚(yú)鏈球菌感染的免疫反應(yīng)中具有重要作用，王瑞等[18]研究顯示無(wú)乳鏈球菌在正常水溫下感染羅非魚(yú)，24 h 后HSP70 mRNA 表達(dá)量是正常脾臟組織的5.5 倍多。在常溫下，HSP70 在抗細(xì)菌感染方面發(fā)揮重要功能，但在高溫下，HSP70 在抗細(xì)菌感染過(guò)程中的重要功能還罕見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)以尼羅羅非魚(yú)（O.niloticus）為例，對(duì)其生長(zhǎng)最適水溫和高溫應(yīng)激下無(wú)乳鏈球菌感染后的魚(yú)體死亡率以及在不同感染時(shí)間下HSP70 基因表達(dá)情況變化進(jìn)行研究，探討不同水溫對(duì)尼羅羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌引起發(fā)病的基因表達(dá)機(jī)制，以期了解和掌握尼羅羅非魚(yú)的免疫防御機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株和羅非魚(yú)

1）試驗(yàn)菌株分離自廣西某養(yǎng)殖場(chǎng)，并經(jīng)回歸感染證明具有較強(qiáng)毒力，經(jīng)生化鑒定及16S rRNA 分子鑒定，確定該菌為無(wú)乳鏈球菌，保存于廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-70 ℃超低溫冰箱。

2）尼羅羅非魚(yú)購(gòu)自廣西某養(yǎng)殖場(chǎng)，魚(yú)體質(zhì)量為（100±10） g，人工感染試驗(yàn)前，在實(shí)驗(yàn)室分別于28 ℃和35 ℃水溫下暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖玻璃缸體積為50 L，按常規(guī)飼養(yǎng)方法管理，每天換水1/4 體積。

1.2 試劑和試劑盒

引物由安徽通用生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 人工感染試驗(yàn)

從-70 ℃冰箱取出無(wú)乳鏈球菌接種于腦心浸液（BHI）液體培養(yǎng)基中，于搖床28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，菌液以3 000 r/min 離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，細(xì)菌計(jì)數(shù)板10 倍梯度稀釋進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，并配成濃度為1×109CFU/mL 的菌懸液。半數(shù)致死量（LD50）的確定：參考祝璟琳等[19]的半數(shù)致死量進(jìn)行驗(yàn)證，確定無(wú)乳鏈球菌的半致死濃度為1.5×108CFU/mL。

表1 定量PCR 引物序列

1）LD50攻毒試驗(yàn)：將60 尾羅非魚(yú)在28 ℃和35 ℃養(yǎng)殖，試驗(yàn)組和對(duì)照組各15 尾，取1.5×108CFU/mL 的無(wú)乳鏈球菌0.1 mL 進(jìn)行腹腔注射，15 尾魚(yú)體感染后于0（攻毒前）、24、48、96、120 h 觀察羅非魚(yú)的累計(jì)死亡情況。

2）1/3LD50攻毒試驗(yàn)：將30 尾羅非魚(yú)在35 ℃養(yǎng)殖，試驗(yàn)組和對(duì)照組各15 尾，試驗(yàn)組取5×107CFU/mL 的無(wú)乳鏈球菌0.1 mL 進(jìn)行腹腔注射，感染后于0（攻毒前）、24、48、96、120 h 分別從每個(gè)養(yǎng)殖桶中取3 尾魚(yú)，取尼羅羅非魚(yú)鰓、肝臟、脾臟和腸道切成大小為100 mg 的小塊，放在-70 ℃冰箱備用或立即進(jìn)行組織中HSP70 mRNA 和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.4 定量PCR 試驗(yàn)

提取組織總RNA，采用Rever Tra Ace qPCR RT Kit 試劑盒，把RNA 在65 ℃下熱變性5 min后，立即放冰上冷卻，加入反應(yīng)體系中的其他成分，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)液組成見(jiàn)表2。

表2 反應(yīng)液組成

反應(yīng)條件：37℃、15 min，70 ℃、5min。放-20 ℃冰箱保存，進(jìn)行Realtime PCR 反應(yīng)時(shí)，將其作為模板直接或稀釋后加入。

應(yīng)用SYBR Rremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）TaKaRa 試劑盒，熒光定量PCR 反應(yīng)體系（反應(yīng)在冰上進(jìn)行）見(jiàn)表3。

表3 反應(yīng)體系組成成分

反應(yīng)條件分3 步：①預(yù)變性（1 個(gè)循環(huán)）：95 ℃，30 s；②PCR 反應(yīng)（40 個(gè)循環(huán)）：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s；③熔解曲線（1 個(gè)循環(huán)）：60～95 ℃。

用ddH2O 來(lái)代替cDNA 作為陰性對(duì)照，用看家基因beta-actin 作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)的內(nèi)參。采用相對(duì)定量法得出各個(gè)樣本△Ct 值（目的基因Ct 值- 內(nèi)參基因Ct 值），應(yīng)用2-△△Ct法來(lái)計(jì)算基因表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2003 進(jìn)行初步處理，再用SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比較（Duncan 氏法）檢驗(yàn)差異性，P＜0.05 表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水溫對(duì)尼羅羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后累計(jì)死亡率的影響

人工感染后，28 ℃和35 ℃水溫下的瀕死尼羅羅非魚(yú)都不同程度地表現(xiàn)出無(wú)乳鏈球菌引起的典型癥狀，如游姿失衡，打轉(zhuǎn)，角膜混濁，鰭條基部充血，一些魚(yú)表現(xiàn)出突眼癥狀，解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟充血，膽囊腫大等。感染后瀕死尼羅羅非魚(yú)體內(nèi)分離的細(xì)菌經(jīng)API 20 Strep 鑒定為無(wú)乳鏈球菌。LD50攻毒試驗(yàn)中（表4），28 ℃組試驗(yàn)?zāi)崃_羅非魚(yú)在感染后48 h 內(nèi)沒(méi)有死亡，感染120 h 的累計(jì)死亡率為20%（3 尾）；而35 ℃組試驗(yàn)?zāi)崃_羅非魚(yú)在感染24 h 后累計(jì)死亡率就達(dá)到13.3%（2 尾），之后一直顯著高于28 ℃組，在感染120 h 后累計(jì)死亡率達(dá)到53.3%（8 尾）。

2.2 無(wú)乳鏈球菌感染尼羅羅非魚(yú)HSP70 mRNA 表達(dá)的影響（28 ℃）

在28 ℃水溫下飼養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)，人工感染無(wú)乳鏈球菌（1/3LD50）后，在24、48、72、96、120 h 分別取尼羅羅非魚(yú)的肝、腸、鰓和脾組織進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表4 28 ℃和35 ℃水溫下不同時(shí)間點(diǎn)魚(yú)的累計(jì)死亡情況 尾

1）各組魚(yú)肝臟中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著（P＜0.05，下同）；48 h 和24 h相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h相比，差異不顯著（P＞0.05，下同）。

2）各組魚(yú)腸中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

3）各組魚(yú)鰓中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且24 h 的表達(dá)量為最高；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量顯著降低，差異顯著；72 h 和48 h相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量差異不顯著；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

4）各組魚(yú)脾臟中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

2.3 無(wú)乳鏈球菌感染尼羅羅非魚(yú)HSP70 mRNA 表達(dá)的影響（35 ℃）

在35 ℃水溫下飼養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)，人工感染無(wú)乳鏈球菌后，在24、48、72、96、120 h 分別取尼羅羅非魚(yú)的肝、腸、鰓和脾組織進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 不同感染組織熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（28 ℃）

1）各組魚(yú)肝臟中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

2）各組魚(yú)腸中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

圖2 不同感染組織熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（35 ℃）

3）各組魚(yú)鰓中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且24 h 的表達(dá)量為最高；48 h和24 h 相比，表達(dá)量顯著降低，差異顯著；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量差異不顯著；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

4）各組魚(yú)脾臟中，HSP70 基因的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。24 h 和0 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著；48 h 和24 h 相比，表達(dá)量升高，差異顯著，且48 h 的表達(dá)量為最高；72 h 和48 h 相比，表達(dá)顯著下降；72 h 和0 h 相比，表達(dá)量略高，接近0 h 水平；96 h 和120、0 h 相比，差異不顯著。

3 討 論

水溫是影響魚(yú)類生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，隨著水溫升高，魚(yú)的活動(dòng)和攝食量增加，但當(dāng)溫度超過(guò)魚(yú)體最適溫度后，魚(yú)的生長(zhǎng)隨著水溫的升高反而受到抑制。羅非魚(yú)正常發(fā)育與生長(zhǎng)的溫度范圍是20～35 ℃，最適生長(zhǎng)溫度一般為29～31 ℃[20]。無(wú)乳鏈球菌是影響魚(yú)類健康的重要病原，在水溫高于26 ℃才會(huì)發(fā)生，而水溫高于32 ℃時(shí)，魚(yú)類更容易暴發(fā)無(wú)乳鏈球菌病，在水溫33 ℃時(shí)累計(jì)死亡率比30 ℃時(shí)更高[21]，這可能與無(wú)乳鏈球菌等細(xì)菌在接近37 ℃時(shí)更容易生長(zhǎng)相關(guān)。劉志剛等[22]研究表明，無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)的毒力與溫度的變化相關(guān)，原因是溫度參與了無(wú)乳鏈球菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控，如促進(jìn)無(wú)乳鏈球菌生長(zhǎng)、黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。Kayansamruaj 等[23]研究表明，羅非魚(yú)分別在35 ℃和29 ℃水溫中感染無(wú)乳鏈球菌后，前者的溶血能力是后者的5 倍；相應(yīng)地，無(wú)乳鏈球菌的毒力基因和炎性基因的表達(dá)也顯著上調(diào)，死亡率也顯著增加。本研究結(jié)果表明，在相同無(wú)乳鏈球菌量感染羅非魚(yú)的條件下，水溫35 ℃時(shí)，尼羅羅非魚(yú)累計(jì)死亡率比28 ℃時(shí)更高，這一結(jié)果和前人的研究結(jié)果一致。說(shuō)明溫度應(yīng)激是影響無(wú)乳鏈球菌致病性的重要因素，高溫抑制了魚(yú)體免疫系統(tǒng)，同時(shí)有利于病原菌的生長(zhǎng)繁殖，有利于病原菌毒力基因的表達(dá)，降低了羅非魚(yú)對(duì)病原菌的抵抗力[24]。

研究結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌感染能引起感染部位HSP70 基因先升高后降低的趨勢(shì)，96 h 和120、0 h相比，差異不顯著。這說(shuō)明熱休克蛋白的大量表達(dá)有助于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，改善細(xì)胞的生存能力和提高對(duì)環(huán)境脅迫或傷害的耐受性。鰓中的HSP70 mRNA 在24 h 就達(dá)到最高值，而肝脾腸道中是48 h 才達(dá)到最高值。這可能是因?yàn)轹w暴露在水中，更容易接觸到細(xì)菌，更加容易引起感染，感染后mRNA 表達(dá)開(kāi)始上升。

4 結(jié) 論

水溫35 ℃組無(wú)乳鏈球菌感染的羅非魚(yú)累計(jì)死亡率顯著高于28 ℃組，水溫28 ℃組和35 ℃組的HSP70 基因的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。無(wú)乳鏈球菌感染，能引起感染部位HSP70 基因表達(dá)先升高后降低的趨勢(shì)。鰓中的HSP70 mRNA 在24 h 就達(dá)到最高值，說(shuō)明鰓更加容易引起細(xì)菌感染。